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细胞培养技术知多少

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众所周知细胞培养基的种类繁多,细胞培养方式也较多,如何正确地使用培养基及最大程度地保持培养基的营养以维持细胞的生长,对每个培养者都很重要。培养基的使用依不同的培养基种类、培养方式、细胞种类的不同而存在差异。


今天我们就继续通过一些许多人惯有的疑问带大家剖析一下哺乳动物细胞培养的基础知识!实验室的小师弟小师妹们,快把你们的眼神望过来!(前辈们也可以复习一下哦)


Q1

不恰当地保存我的组织培养试剂会影响培养物的生长速率吗?


会。动物血清应储存于–5至–20°C。培养基储存于2至8°C;请在推荐的保质期内用完。请将完全培养基(加入添加剂)保存于2 至 8°C,推荐的存放期限为2至4周。此外,尽量减少血清和培养基暴露于光线下的时间。



Q2

生物安全级别(Biosafety Level , BSL)的1至4级之间有何区别?


美国在生物安全方面的规章和建议公布于《微生物学与生物医学实验室的生物安全》文档中,该文件由疾病控制中心(CDC)与国立卫生研究院(NIH)共同撰写,由美国卫生与人类服务部发布。该文件定义了逐步增加的4个污染等级,简称为1至4级生物安全级别,其中描述了操作某一特定试剂所对应的风险级别,及其相应的微生物学方法,安全设备与设施保障。 

生物安全级别1(BSL-1):BSL-1是大多数研究型与临床型实验室常规使用的基础保护级别,适用于那些不会导致正常健康人体发生疾病的试剂。 

生物安全级别2(BSL-2):BSL-2适用于摄入后或经皮肤或粘膜接触会导致不同程度人类疾病的中等风险性试剂。大多数细胞培养实验室需至少达到BSL-2级别,但实际要求需基于所用的细胞系和所执行的工作类型来决定。 

生物安全级别3(BSL-3):BSL-3适合于已知的具有潜在空气传播性的本土或外来制剂,以及可能引起严重和潜在致命感染的试剂。 

生物安全级别4(BSL-4):BSL-4适用于具有高个体风险的外来制剂——这些制剂会通过空气传播造成生命威胁性疾病,且无可用治疗方案。这些试剂仅限于在高度封闭的实验室内应用。


Q3

在培养哺乳动物细胞时,我应将CO2培养箱设置为何种缓冲条件?


大多数常规哺乳动物细胞系在pH7.4的条件下生长良好,不同的细胞株系之间差异极小。大多数研究人员通常使用含5–7% CO2的空气,一般而言,4–10%的CO2浓度即可满足绝大多数的细胞培养实验要求。请点击 此处阅读更多关于缓冲条件的相关信息。



Q4

我应如何维持无菌工艺?


无菌技术的作用是在环境微生物与无菌的细胞培养物之间形成一道屏障,它通过一套操作流程来降低培养物被污染源污染的可能。无菌技术的组成要素包括:无菌工作区域、良好的个人卫生、无菌试剂和培养基以及无菌操作。



Q5

粘附细胞培养与悬浮培养之间有何区别?


细胞培养实验有两种基本的细胞生长系统:在人工基质上的单层培养(即粘附培养)或在培养基中自由漂浮(悬浮培养)。来源于脊椎动物的大部分细胞,除造血细胞系及少数其它细胞系外,均依赖固着性的生长,因此需要专门培养于适当的基质上,且该基质必须经过特殊处理,才能成功地粘附和扩增(即组织-培养处理)。不过,许多细胞株也能够适应悬浮培养条件。以此类似市售的昆虫细胞系在单层或悬浮培养条件下均生长良好。 

悬浮培养的细胞也可培养于未经组织-培养处理的培养瓶中,不过由于培养体积相比表面积有所增加,导致气体交换受阻(通常情况下为0.2-0.5 mL/cm2),因此需要对培养基进行搅动。这一搅动过程一般由磁力搅拌器或旋转培养瓶来完成。 


Q6

我应如何解冻FBS才不会影响其使用性能?


从冰箱中取出血清并在2–8°C条件下过夜融化。随后可在室温下完成解冻过程。在这一过程中,血清应规则地进行混匀。警告:不要将FBS置于37°C条件下孵育过长时间,否则产品可能会变混浊。由于血清中许多成份存在敏感性,其性能也可能受到影响。产品一旦解冻,建议您立即使用。



Q7

是否需要在使用前对血清进行过滤?

不必,使用前并不需要过滤血清。Gibco™血清产品经最为严格的工艺生产,其中就包含有膜过滤步骤。



Q8

热灭活对血清的作用是什么?


热灭活步骤能够灭活补体系统。补体会参与以下事件中:溶解细胞事件,平滑肌收缩,肥大细胞与血小板释放组胺,吞噬作用增强,趋化作用,淋巴细胞与巨噬细胞的活化等。



Q9

血清需要在何种温度下,经多长时间才能完成热灭火处理?


您可将解冻后的产品置于56°C的恒温控制下孵育30分钟。我们所提供塑料和玻璃瓶装的血清产品均能胜任热灭活处理。警告:不要试图以更高的温度和更长的时间来热灭活血清产品,这样的条件会导致蛋白变性,进而降低产品性能。



Q10

何为胎牛血清中的BVD病毒?该病毒对细胞培养应用造成怎样的影响?


BVD会造成牛的病毒性腹泻。该病症是牛最为常见的病毒感染症状之一。据估计在世界范围内,牛种群中估计有百分之七十至九十的个体血清为BVD阳性。该病毒会导致牛发病和流产。也有部分现存的BVD毒株是非致病性的。在细胞培养应用中,联邦法规(9CFR)对生物制品生产所用细胞系和原料提出了一些要求。用于生产生物制品的血清要求具有阴性的BVD病毒检测结果。


GibcoTM血清的BVD病毒测试均按照9CFR中的检测方案来进行。我司内部划分为0至4级(根据检测结果)。结果为0意味着遵照9CFR测试方案,本批血清的病毒检测结果为阴性。1-4级的检测结果表明本批血清为病毒阳性。A+1表明病毒发出较低荧光,a+4表示病毒荧光较强。该批次的质检报告中会标记“经测试(tested)”一词,而非实际的BVDV抗体荧光强度。

某一批次的血清产品按照9CFR方案测试结果为0,而在使用PCR一类更新更灵敏的技术测试时则可能出现阳性结果。为了确保该批次血清“真正”为BVD病毒阴性,需对其进行伽马辐照等的处理。


Q11

我应如何判断我的细胞培养是否需要进行血清热灭火操作呢?


通常确认是否需要此操作的最好办法是咨询您获取细胞的来源。举例来说,ATCC对于他们所销售的细胞就有血清方面的要求。多数昆虫细胞系与胚胎干细胞系都需要应用热灭活的血清。



Q12

NovexTM样品缓冲液中使用酚红的目的是什么?


酚红在极小孔径的凝胶中被做为示踪染料,可以显示真实的离子前端(ion-front),尤其适合应用于Tricine胶。酚红比Coomassie™ Blue G-250的分子量更小。在高浓度凝胶中,这一大小区间内的分子将会基于分子量大小而被解离开来,酚红伴随离子前端共同泳动,而G-250会滞后离子前端2 cm处泳动。在适于分离更大蛋白的凝胶中——如NuPAGE™凝胶——G-250会伴随离子前端共同泳动,通常也是最为常用跟踪染料。



Q13

哪些细胞可以培养于去外泌体的FBS中?我又应该使用何种FBS浓度?


我们专门测试了Jurkat、MCF-7、HeLa、PC3、HEK293与A549细胞,所有这些种类的细胞都生长良好。HeLa细胞对于去外泌体FBS的存在最为敏感。您可能需要对去外泌体FBS的浓度进行调整,以匹配特定细胞系与培养系统的需要。我们推荐您以10%做为去外泌体FBS应用的起始浓度,在需要时进行上调或下调。同时,去外泌体FBS通过了单次传代后48小时的培养测试和验证(我们也成功完成了对HeLa、MCF-7和HEK293等细胞系长达96小时的培养测试)。


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