秋水仙碱对人瘢痕疙瘩成纤维细胞MMP-1、MMP-2及MMP-9表达的影响

瘢痕疙瘩是皮肤损伤后结缔组织过度增生和透明变性而引起的皮肤良性肿瘤，其中成纤维细胞及其产生的胶原纤维在瘢痕形成过程中发挥着重要作用。相关研究资料表明，秋水仙碱可与微管蛋白二聚体结合，阻止微管蛋白转换，从而导致细胞死亡，具有抗炎、抗纤维化作用，而其抑制瘢痕疙瘩的形成则主要是通过调节成纤维细胞内基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）的表达而发挥作用，但具体调节机制尚无深入报道。为此，笔者鉴于实验研究显示，当秋水仙碱浓度＞100 μg/mL时，可杀死瘢痕疙瘩中的所有成纤维细胞（keloid fibroblast，KFB），遂于本研究中对比观察了浓度在0～100 μg/mL范围内不同浓度的秋水仙碱对人KFB内MMP-1(胶原酶)、MMP-2（明胶酶A）和MMP-9（明胶酶B）表达的影响，以期为临床选择瘢痕疙瘩的治疗药物及秋水仙碱的药物浓度提供新的靶点和方向。

秋水仙碱：美国Sigma-Aldrich公司生产；RNAiso^TM Plus、PrimeScript^TM RT Kit、Premix Taq、DNA Marker、PCR扩增引物：宝生物工程（大连）有限公司生产；胎牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司生产；全蛋白提取试剂盒：江苏凯基生物技术股份有限公司生产；BCA蛋白浓度测定试剂盒：美国Pierce公司生产；MMP-1单克隆抗体（SC21731）、MMP-2单克隆抗体（SC13595）、GAPDH单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG：美国Santa Cruz公司生产；ECL化学发光检测试剂盒：美国Millipore公司生产。

本组研究对象共7例，均为2015年3月—2015年5月重庆医科大学附属第一医院烧伤整形科收治的病程为6～24个月的瘢痕疙瘩患者。所有患者对本研究知情同意，并签署了知情同意书。

将手术切除的瘢痕组织进行PBS(pH=7.4)缓冲液冲洗3次后，用眼科剪剪除皮下组织，然后用PBS缓冲液冲洗修剪后的瘢痕组织至缓冲液澄清且无漂浮物；用眼科剪将处理好的瘢痕组织剪成0.5～1.0 mm³的碎块，并用吸管或镊子将组织块接种于培养瓶或培养皿中（组织块间隙约0.5 cm）；将培养瓶或培养皿置于饱和湿度的培养箱中培养1～2 h(37℃，5.0% CO₂)，待组织块贴壁后，加入含12%胎牛血清的DMEM培养基至组织块被液体完全淹没后继续培养，每2～3 d更换1次培养基；待细胞基本融合成片（密度达80%时）后，吸除培养基，并用PBS缓冲液漂洗3次后，加入浓度为0.125%的胰蛋白酶消化液浸泡约1 min；待镜下可见细胞质回缩、细胞间隙增大后，再次加入含12%胎牛血清的DMEM培养基，并用弯头吸管轻轻吹打细胞至培养瓶或培养皿中呈细胞悬液后，按1:2的比例分瓶传代。

待细胞培养至第3代时，加入浓度为0.125%的胰蛋白酶消化液浸泡至细胞质回缩、细胞间隙增大后，转种于75.0 cm²的培养瓶中（1×10⁶/瓶）继续培养；待细胞基本融合成片（密度达85%时）后，分别将每例患者瘢痕组织的传代培养细胞分为A组、B组、C组、D组及E组，A组加入含胎牛血清的DMEM培养基继续培养备用，B组、C组、D组、E组加入含胎牛血清的DMEM培养基及浓度分别为2、4、8、16 μg/mL的秋水仙碱继续培养24 h(37℃，5.0% CO₂)后备用。

1.3.1  RT-PCR法检测MMP mRNA的表达水平  采用Trizol法提取各组细胞的RNA，并用GeneQuant核酸定量分析仪测定其浓度和纯度后，将比值＞1.6且经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定符合要求的RNA置于-80℃冰箱内保存备用。取备用RNA分别于94℃下预变性4 min、94℃下预变性30 s、59℃下预变性30 s及72℃下预变性30 s，并重复操作30次后，于72℃下预变性10 min，进行逆转录扩增。PCR引物序列及产物长度分别为：MMP-1上游引物序列为5'-gattcggggagaagtgatgttc-3'，下游引物序列为5'-ctcctttggcttccctagaact-3'，产物长度为253 bp；MMP-2上游引物序列为5'-actgttggtgggaactcagaag-3'，下游引物序列为5'-cctctcctgacattgaccttg-3'，产物长度为346 bp；MMP-9上游引物序列为5'-gcaccaccacaacatcacctat-3'，下游引物序列为5'-gatgacgagttgtggtccctg-3'，产物长度为289 bp；β-actin上游引物序列为5'-gacccagatcatgtttgagacc-3'，下游引物序列为5'-cgacaggatgcagaaggagat-3'，产物长度为594 bp。最后，取PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳后用UVP凝胶图像扫描系统采集图像，并采用Quantity One分析软件分析条带结果。

1.3.2  Western blot法检测MMP蛋白的表达水平  按照全蛋白提取试剂盒的说明方法提取蛋白，并根据BCA蛋白浓度测定试剂盒的说明方法测定蛋白含量；将蛋白组织进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h后，加入MMP-1(MMP-2，MMP-9)单克隆抗体（稀释比例为1:800），4℃孵育过夜；继而加入辣根过氧化物酶山羊抗小鼠IgG（稀释比例为1:2000），37℃孵育30 min后，加入化学发光剂，并采用化学发光成像分析系统检测蛋白灰度值。

采用SPSS 13.0统计软件对实验数据进行统计学分析，计量资料以（均数±标准差）表示，各组间对比采用单因素方差分析，组间两两对比采用q检验，均以P＜0.05为差异具有统计学意义。

A组、B组、C组、D组、E组KFB中MMP-1 mRNA的表达水平分别为（0.174±0.016）、（0.282±0.015）、（0.369±0.022）、（0.541±0.027）及（0.672±0.020），MMP-2 mRNA的表达水平分别为（0.201±0.033）、（0.371±0.026）、（0.548±0.031）、（0.653±0.019）及（0.796±0.024），而MMP-9 mRNA均未见表达。与A组对比，B组、C组、D组及E组KFB中MMP-1 mRNA及MMP-2 mRNA的表达水平均较高，P均＜0.01，差异具有统计学意义，且B组、C组、D组及E组呈逐渐增高趋势，P＜0.01，差异具有统计学意义，即随着秋水仙碱浓度的增高，KFB中MMP-1 mRNA及MMP-2 mRNA的表达水平均逐渐增高（表1，图1-3）。

图1  RT-PCR法检测各组KFB中MMP-1 mRNA的表达（M为DNA Marker）；图2  RT-PCR法检测各组KFB中MMP-2 mRNA的表达（M为DNA Marker）；图3  RT-PCR法检测各组KFB中MMP-9 mRNA的表达（M为DNA Marker）

A组、B组、C组、D组、E组KFB中MMP-1蛋白的表达水平分别为（0.127±0.031）、（0.205±0.013）、（0.293±0.027）、（0.349±0.034）及（0.512±0.035），MMP-2蛋白的表达水平分别为（0.278±0.023）、（0.395±0.036）、（0.526±0.025）、（0.673±0.014）及（0.792±0.037），MMP-9蛋白均未见表达。与A组对比，B组、C组、D组及E组KFB中MMP-1蛋白及MMP-2蛋白的表达水平均较高，P均＜0.01，差异具有统计学意义，且B组、C组、D组及E组呈逐渐增高趋势，P＜0.01，差异具有统计学意义，即随着秋水仙碱浓度的增高，KFB中MMP-1蛋白及MMP-2蛋白的表达水平均逐渐增高（表2，图4-5）。

成纤维细胞的生长、迁移及胶原蛋白等细胞外基质的合成在创伤修复过程中发挥着极其重要的作用。研究显示，在创面修复过程中，一旦胶原蛋白的合成与降解平衡被打破，致使大量胶原蛋白堆积，即会导致瘢痕疙瘩的形成；而MMP，特别是MMP-1、MMP-2及MMP-9作为一种Zn依赖性中性蛋白酶，可参与细胞外基质的降解与再塑造，进而维持细胞外基质的动态平衡。秋水仙碱作为一种卓酚酮类生物碱，其内含有的C环可与微管蛋白结合，阻止微管蛋白聚合成纺锤丝，使细胞停止于有丝分裂中期，从而导致细胞死亡，发挥抗炎、抗肿瘤等作用。动物实验研究证实，秋水仙碱可刺激中毒性肝炎小鼠肝细胞内胶原酶的活性，促进胶原蛋白的降解；可有效缓解四氯化碳所致的中毒性肝炎小鼠的肝脏毒性，防治肝脏的纤维化及淀粉样变性。也有研究显示，秋水仙碱可影响MMP的表达，且其表达水平会随着浓度的增高而增高，遂笔者于本研究中对比观察了不同浓度秋水仙碱对人KFB中MMP-1、MMP-2和MMP-9表达的影响。

本研究结果显示，随着秋水仙碱浓度的增高，人KFB中MMP-1 mRNA、MMP-2 mRNA、MMP-1蛋白及MMP-2蛋白的表达水平均呈逐渐增高趋势，P均＜0.01，差异具有统计学意义，而MMP-9 mRNA及MMP-9蛋白均未见表达。与杜航航等研究的随着秋水仙碱浓度的不断增高，人肾脏KFB合成与分泌的MMP-1及MMP-2呈剂量依赖性增加的结果一致。而MMP-9未见表达，可能与其在KFB中表达量较低或离体细胞培养后未表达有关，相关原因仍需进一步研究探索。研究显示，秋水仙碱能够促进胶原酶的合成，进而影响KFB中MMP-1与MMP-2的表达，但因本研究并未观察秋水仙碱对KFB胶原蛋白转录水平的影响，故具体作用机制仍需进一步深入研究探讨。

综上所述，秋水仙碱可促进人KFB中MMP-1与MMP-2的表达，从而达到抗纤维化、抑制瘢痕疙瘩形成的目的，且在一定浓度范围内，其作用随着秋水仙碱浓度的增高而逐渐增强，有望成为临床治疗瘢痕疙瘩的一线药物，其药物剂型、药物浓度等方面的研究将成为今后该领域的研究方向。

 （参考文献略）