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大肠杆菌感受态细胞的制备和转化

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     一. 材料
    E. coli DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ;pBS质粒DNA: 购买或实验室自制,eppendorf管。
  二. 设备
  恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工作台,低温冰箱, 恒温水浴锅, 制冰机, 分光光度计,微量移液枪。
  三. 试剂
    1.LB固体和液体培养基:配方见第一章。
    2.Amp母液:配方见第一章。
    3.含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。
    4.麦康凯培养基(Maconkey Agar):取52g麦康凯琼脂,加蒸馏水1000ml,微火煮沸至完全溶解,高压灭菌,待冷至60℃左右加入Amp储存液使终浓度为50ug/ml,然后摇匀后涂板。
    5.0.05mol/L CaCl2溶液:称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌。
    6.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2: 称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌。


操作步骤 


  一、 受体菌的培养
  从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 =0.5左右。


  二、 感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)
    1、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃3000g离心10分钟。
    2、 弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃3000g离心10分钟。
    3、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。
    4、感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-70℃可保存半年。 


  三、转化
    1、从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上。
    2、加入pBS质粒DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超过10μl),轻轻摇匀,冰上放置30分钟后。
    3、42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟,热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。
    4、向管中加入1ml LB液体培养基(不含Amp),混匀后37℃振荡培养1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr)。
    5、将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时。

 同时做两个对照:
  对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。
  对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上,此组正常情况下应产生大量菌落。


  四、 计算转化率
  统计每个培养皿中的菌落数。
  转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子,根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率,公式如下:
  转化子总数=菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积/涂板菌液体积
  转化频率(转化子数/每mg质粒DNA)=转化子总数/质粒DNA加入量(mg)
  感受态细胞总数=对照组2菌落数×稀释倍数×菌液总体积/涂板菌液体积
  感受态细胞转化效率=转化子总数/感受态细胞总数  
[注意]
本实验方法也适用于其它E.coli受体菌株的不同的质粒DNA的转化。但它们的转化效率并不一定一样。有的转化效率高,需将转化液进行多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板,而有的转化效率低,涂板时必须将菌液浓缩(如离心),才能较准确的计算转化率。 



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