分子生物学-动物组织基因组DNA分离提取与纯化

一、实验目的

当需要大量哺乳动物DNA，如用于Southern Blot分析，或者是用于基因型鉴定、遗传疾病分析等，则需要选用这种方法从动物组织中提取高纯度的基因组DNA（GenomicDNA）。

二、注意事项

使用的实验材料不同（单层培养细胞、悬浮培养细胞、组织样品、新鲜或冻存血液等），其实步骤可能有差异，本实验计划从动物脚趾组织提取基因组DNA。

三、实验材料及试剂

小鼠脚趾组织、组织裂解液（SNET）、蛋白酶K、酚/氯仿/异戊醇、异丙醇、70%乙醇、TE（pH8.0）、灭菌双蒸水、1.5ml离心管、离心管架、加样器（1 mL、200 μL、100 μL、10 μL）、加样枪头（蓝色、黄色、白色）、记号笔、一次性手套等。

四、实验仪器

水浴锅、低温离心机、Nanodrop核酸分析仪。

五、实验步骤

1、剪取小鼠脚趾，放入1.5mL离心管中，-20℃冰箱保存备用。

2、每管中加入300 μLSNET（含蛋白酶K，10 μg/mL），55℃水浴锅中消化过夜。经过过夜消化后，应该看不到组织。（已提前准备好）

3、取出离心管（各小组在管盖上给离心管进行编号，例如M1，M2，……）。短暂离心，小心打开管盖，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇溶液（300 μL），盖上管盖。剧烈震荡30S，室温静置5min。

4、离心，12,000g，10min，4℃。注意！配平离心机。

5、取出离心管，注意不要晃动。小心转移上层水相至另一新的离心管中（约300μL。需要按前面的要求在管盖上编号，M1，M2，……）。轻按加样器至最低位置，轻轻将枪头插入上层水相液面下方，缓慢释放加样器，注意不要吸取中间蛋白层和下次有机相。

6、加入等体积（300μL）异丙醇沉淀DNA，此时可能会看到絮状漂浮物，即为基因组DNA）。盖上管盖，混匀后室温静止5min。

7、离心，12,000g，5min，4℃。此步目的是沉淀DNA。

8、离心后可以在管底看到白色沉淀。将上层异丙醇丢弃（倒出即可），加入1 mL70%乙醇清洗沉淀。盖上管盖，晃动离心管使基因组DNA重悬于乙醇溶液中。次步目的是去除沉淀中的杂质。

9、离心，7,500g，5min，4℃。在等待间隙配制0.1倍的TE溶液1ml（100μL+900 μL灭菌水）。

10、取出离心管，小心打开管盖，丢弃70%乙醇。室温下干燥沉淀约15-20min（注意：不要让DNA过分干燥，否则较难溶解）。或盖上管盖，7,500g，短暂离心1min，使用加样器将多余的液体吸出。（推荐使用此种方法）

11、加入150 μL 0.1倍TE溶液，放入55 ℃水浴锅中助溶30 min。剩余的TE溶液不要丢弃，下一步检测DNA浓度时需要使用。

12、使用Nanodrop测定基因组溶液中DNA浓度以及260/280的比值等，初步判断基因组DNA的质量。

13、得到的基因组DNA溶液-20 ℃保存备用（下次PCR实验需要使用本次实验提取的基因组DNA溶液作模板）。

六、实验结果

1、基因组DNA浓度是多少？

2、基因组DNA OD260/280与OD260/230比值。

七、思考问题

1、在组织裂解液中加入蛋白酶K的作用是什么？

2、异丙醇沉淀DNA的原理是什么？

3、为什么在保存或抽提DNA过程中，一般采用TE缓冲液？

4、DNA浓度测定过程中OD260、OD280反应DNA溶液的那种特征？为什么要测定OD260/280比值？

附：组织裂解液配方

10mM Tris-Cl (pH 8.0)

15mM NaCl

10mM EDTA (pH8.0)

0.4%SDS

使用前加入终浓度为10 μg/ml的蛋白酶K