血清长链非编码RNA BC200表达在胃癌诊疗中的应用价值

• 任浩 王昌敏 杨晓敏 张笑雨 魏冉 赵瑞 张欣 杨咏梅 张义

选自中华检验医学杂志, 2017,40(02)

胃癌是我国死亡率居第二位的恶性肿瘤，由于胃癌患者早期无明显特异性临床症状，多数胃癌患者就诊时已经进展到中晚期，手术治疗效果不佳，是胃癌患者死亡率高的重要原因之一。早期胃癌患者的预后及生存率远好于晚期胃癌，早期诊断对患者的治疗和预后具有重要意义^[1,2,3]。长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度大于200个核苷酸、不编码蛋白质的RNA，其参与调节多种重要的细胞活动，与很多人类疾病的发生发展相关^[4]。研究表明，lncRNA BC200是一种与肿瘤细胞的增殖侵袭密切相关的lncRNA^[5,6]。本研究旨在分析血清中lncRNA BC200表达水平与胃癌临床特征的关系，探讨其在胃癌诊断、疗效监测中的价值。

对象与方法

一、对象

选取2014年11月至2015年7月山东大学齐鲁医院收治的胃癌患者124例，其中男89例，女35例，年龄32～88岁，平均年龄58岁，术前未行化疗、放疗，术后经组织病理确诊为胃癌，按照2010年国际抗癌联盟/美国癌症联合委员会TNM分期标准进行分期，其中Ⅰ期23例、Ⅱ期34例、Ⅲ期54例、Ⅳ期13例。选取同期胃镜检查结果为萎缩性胃炎患者41例作为癌前病变组，男26例，女15例，年龄25～68岁，平均年龄55岁。同期体检健康者59名作为健康对照组，男30名，女29名，年龄22～87岁，平均年龄53岁。实验经山东大学齐鲁医院伦理委员会批准[批号：KYLL-2015(KS)-053]，所有患者知情同意。

二、方法

1．仪器与试剂：Trizol RNA提取试剂(美国Thermo公司)；逆转录试剂盒及实时荧光定量PCR试剂盒(大连宝生物工程有限公司)；CFX 96实时荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)；Cobas E601电化学发光免疫分析仪及CEA、CA72-4检测试剂(瑞士Roche公司)。

2．标本收集：采集研究对象空腹静脉血，分离血清，250 μl/管分装，－80 ℃保存备用。

3．血清样本总RNA的提取：向250 μl血清中加入750 μl Trizol试剂，颠倒混匀，室温静置10 min，加入200 μl氯仿，剧烈振荡15～30 s，室温静置15 min，4 ℃ 12 000×g离心15 min,转移上层无色透明液体至EP管中，加入异丙醇500 μl，颠倒混匀6～8次，置于－20 ℃冰箱过夜，4 ℃ 7 500×g离心10 min，用无水乙醇洗涤1次，离心去上清后用10 μl焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)水溶解沉淀。

4．逆转录获得互补DNA(complementary DNA，cDNA)：按照逆转录试剂盒说明书进行逆转录，反应体系：PrimeScript缓冲液(5×)2 μl、PrimeScript逆转录酶混合物0.5 μl、Oligo dT Primer 0.5 μl、Random 6 mers 0.5 μl、DEPC溶液(10 μmol/L)5.5 μl、总RNA(500 ng/μl)1 μl。反应条件如下：37 ℃ 15 min, 85 ℃ 5 s，生成的cDNA用DEPC溶液稀释10倍存于－20 ℃备用。

5．实时荧光定量PCR：采用Riobio公司设计的PCR引物序列。lncRNA BC200：上游引物序列为5′-CTCAGGGAGGCTAAGAGGCG-3′，下游引物序列为5′-TTTCCTTTTTCTGGAGAACGGG-3′；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehy drogenase，GAPDH)基因：上游引物序列为5′-ACCCACTCCTCCACCTTTGAC-3′，下游引物序列为5′-TGTTGCTGTAGCCAAATTCGTT-3′。按照实时荧光定量PCR试剂盒说明书进行操作，反应体系(25 μl /每管)：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)12.5 μl、上游和下游引物各1.0 μl、cDNA 2.0 μl、H₂O 8.5 μl。反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，40个循环，通过熔解曲线检测PCR产物的特异性。每孔均设3个复孔，取平均CT值做为该样本最后CT值，以GAPDH基因作为内参基因，计算2^－ΔΔCT值反映lncRNA BC200表达水平。

6．测定血清CEA及CA72-4水平。使用Cobas E601电化学发光免疫分析仪检测血清CEA及CA72-4水平，每个样本重复测定3次，取平均值作为该样本CEA及CA72-4最终浓度。

三、统计学分析

采用SPSS 19.0进行统计分析。采用Kolmogorov-Smirnov检验(K-S检验)对数据进行正态分布检验。非正态分布的计量资料以中位数(四分位数)表示，两组间资料数据比较采用Mann-Whitney U检验；多组资料数据间比较采用单因素非参数Kruskal-Wallis H检验。用多因素logistic回归分析计算lncRNA BC200、CEA、CA72-4联合诊断的预测概率；用MedCalc软件绘制ROC曲线，确定各条ROC曲线的临界值及该处诊断指标的特异性和敏感性，计算AUC评估lncRNA BC200、CEA、CA72-4及三者联合诊断的检验效能。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、不同分组lncRNA BC200表达水平比较分析

采用实时荧光定量PCR检测124例胃癌患者(其中Ⅰ期23例、Ⅱ期34例、Ⅲ期54例、Ⅳ期13例)、41例萎缩型胃炎患者、59名健康体检者血清中的lncRNA BC200的表达水平，经K-S检验分析表明，所有分组计量资料均呈非正态分布，各组数据用中位数(四分位数)表示。胃癌组(Ⅰ＋ Ⅱ期)、胃癌组(Ⅲ ＋ Ⅳ期)、癌前病变组、健康对照组血清lncRNA BC200表达水平分别为1.041(0.794，1.462)、1.290(0.978，1.794)、0.969(0.699，1.219)和0.801(0.556，1.599)，差异有统计学意义(H＝54.68，P<0.000 1)。胃癌组(Ⅰ＋ Ⅱ期)lncRNA BC200表达水平高于癌前病变组和健康对照组(H值分别为50.43、46.90，P均<0.05)；胃癌组(Ⅲ ＋ Ⅳ期)lncRNA BC200表达水平也高于癌前病变组和健康对照组(H值分别为74.55、71.02，P均<0.05)；癌前病变组与健康对照组之间lncRNA BC200表达水平差异无统计学意义(H＝－3.528，P>0.05)。

二、lncRNA BC200与胃癌患者临床参数间的关系

根据不同指标对胃癌患者进行分组，按性别、年龄等指标分为两组的数据之间比较采用Mann-Whitney U检验；按肿瘤分化程度等指标分为两组以上的数据之间比较采用单因素非参数Kruskal-Wallis H检验。Ⅲ期＋Ⅳ期胃癌患者血清lncRNA BC200表达水平高于Ⅰ期＋Ⅱ期患者，差异有统计学意义(P<0.05)；不同性别、年龄、肿瘤分化程度、原发灶面积、淋巴结转移、远处转移的lncRNA BC200表达水平未见统计学差异(P均>0.05)，见表1。

表1 lncRNA BC200表达水平与胃癌患者各项指标的比较

三、手术前后胃癌患者血清lncRNA BC200表达水平的动态监测

对31例成功接受胃癌根治术的患者手术前后血清lncRNA BC200水平进行监测。与术前lncRNA BC200表达水平[1.120(0.859，1.663)]相比，术后3 d[1.150(0.924，1.391)](U＝335.5，P＝0.188)、7 d[0.976(0.779，1.280)](U＝411.0，P＝0.574)的变化差异无统计学意义；术后10 d[0.903(0.724，1.182)](U＝55.0，P<0.000 1)、30 d[0.759(0.671，1.037)](U＝299.0，P＝0.026 1)、100 d[0.478(0.378，0.635)](U＝41.0，P<0.000 1)。患者术后10 d、30 d、100 d血清lncRNA BC200的表达水平较术前有显著降低。

四、血清lncRNA BC200、CEA及CA72-4诊断效能分析

血清lncRNA BC200诊断胃癌的AUC为0.865(95% CI：0.806～0.911)，敏感度92.7%(115/124)、特异度69.1%(38/55)；CEA为0.807(95% CI：0.741～0.862)，敏感度90.3%(112/124)、特异度58.2%(32/55)；CA72-4为0.699(95%CI：0.626～0.765)，敏感度49.2%(61/124)、特异度89.1%(49/55)；3个指标联合检测的AUC为0.934(95% CI：0.887～0.965)，敏感度82.3%(102/124)、特异度92.7%(51/55)。lncRNA BC200、CEA、CA72-4与3组数据联合检测之间差异的P值均<0.001，见图1。

图1

lncRNA BC200、CEA、CA72-4及三者联合检测诊断胃癌的ROC曲线

讨论

胃癌作为一种世界范围内高发的癌症，过去10年在我国男性和女性癌症患者中发生率分别排第2、3位，死亡率在我国癌症人群中排第2位^[3]。早诊断早治疗能够大大提高胃癌患者的预后生存期，但由于胃镜等组织病理学检查手段属于有创检查且操作复杂，不适用于大量人群的筛查，因此血清学肿瘤标志物的检测对于胃癌的早期诊断及疗效观察有着重要意义^[7,8]。目前为止尚未发现特异性的胃癌肿瘤标志物，常用的CEA、CA72-4等胃癌诊断标志物阳性率和准确性都有待提高^[9]。lncRNA是一类长度大于200个核苷酸、不编码蛋白质的RNA，研究证明lncRNA与肿瘤的发生发展有着密切联系，一些常见的lncRNA分子，如HOX转录反义RNA(HOTAIR)、H19等已经在多种肿瘤中的作用得到验证^[4,10]，本研究尝试在lncRNA中寻找可用于胃癌早期诊断及疗效观察的有意义生物标志物。

BC200是一种在人类神经细胞中特异性表达的lncRNA，通过特定的调节机制调节神经元细胞突触小体的形成，在一般正常组织中可以检测到较低表达量的lncRNA BC200，但肿瘤作用下lncRNA BC200在肿瘤组织中表达量明显升高，释放并稳定地存在于血液中，这就为其作为外周血肿瘤标志物提供了可能^[5,6,11]。现有研究证明lncRNA BC200在乳腺癌、非小细胞性肺癌及卵巢癌等肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭以及耐药性方面都发挥重要作用^[6,12]，但尚无研究证实lncRNA BC200在血清中的表达量是否与癌症发生发展相关，本研究着重探讨了其在胃癌血清中表达水平的变化及是否可以作为诊断及疗效观察的可靠生物标志物。

以往研究表明lncRNA BC200在乳腺癌、非小细胞肺癌等癌症中有促进细胞增殖的作用，作用机制与骨髓细胞瘤病毒癌基因(cellular-myelocytomatosis viral oncogene，c-MYC)及基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)有关，lncRNA BC200可能是c-MYC基因的靶基因，而c-MYC基因已被证实具有促进细胞分裂和增殖的作用，同时lncRNA BC200的高表达也使具有降解细胞外基质作用的MMP9和MMP13蛋白的表达增加，从而促进肿瘤细胞的扩散^[13,14]，因此我们有理由认为lncRNA BC200在胃癌的进展中也发挥一定作用。然而进一步统计分析表明胃癌患者的不同年龄、性别、肿瘤大小、淋巴结转移、分化程度、原发灶面积等临床病理参数与lncRNA BC200表达水平之间未见统计学差异，分析原因可能由于lncRNA BC200在促进肿瘤分化、转移等方面作用有待进一步证实，也可能与临床病理资料的完善程度有关，例如不同医生术中对淋巴结清扫范围及送检的选择不同、远处转移的检查是否完善等。31例接受胃癌根治术治疗的胃癌患者术后3 d、7 d血清lncRNA BC200表达水平变化未见统计学意义，而10、30和100 d表达水平与术前相比则表现出显著性降低，分析原因可能是术前从癌组织释放入血清的lncRNA BC200短期内未消除，术后血清lncRNA BC200水平逐渐降低，提示血清中的lncRNA BC200来源于癌组织，术后表达水平降低并维持低水平提示手术效果良好，术后监测血清lncRNA BC200表达水平有助于监测胃癌的疗效和预后。CEA是目前应用最广泛的广谱肿瘤标志物，CA72-4是与胃肠道及卵巢肿瘤特异性相关的肿瘤标志物，在胃癌的血清学诊断中均发挥重要作用，然而CA72-4和CEA仍然存在敏感度和特异度不高的问题，通过ROC曲线分析显示lncRNA BC200诊断胃癌的曲线下面积高于CEA和CA72-4，提高了检测的敏感度，而lncRNA BC200与CEA、CA72-4的联合检测的特异性比每个项目单独检测都有明显提高，联合检测可进一步提高对胃癌的诊断效能。

综上所述，由于lncRNA在外周血稳定存在的特性，与组织病理学诊断相比，血清学无创性特点更适用于大量人群的筛查，经大样本进一步验证lncRNA BC200有望成为胃癌诊断和疗效监测的生物标志物。

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