一、实验目的
学习和掌握醇脱氢酶提纯的原理和方法。
二、实验原理
以酵母为原料，利用热变性、有机溶剂沉淀蛋白质等方法，提取具有一定纯度的醇脱氢酶。在提纯过程中，每经一步提纯处理，都需测定酶蛋白质含量和活力，并计算得比活力①。惟有比活力提高了，才证明所用提纯措施有效，酶制剂的纯度提高了。
醇脱氢酶的辅酶NAD②，它能催化乙醇脱氢变成乙醛，脱下的氢则使 NAD+还原。
当有过量醇存在时，NAD+被还原的速度与酶活力成正比，酶活力愈高，单位时间产生的NADH愈多。 NADH对340nm 紫外线有较强吸收，NAD+无此能力，因此可用测定A340nm的方法测得反应体系中NADH含量，从而得知酶活力的大小。
本实验Folin-酚试剂法测定蛋白质含量
三、实验器材
1.干酵母粉：将鲜酵母分散成小块，放在搪瓷盘吹干。干燥后，研磨成粉末(80目)
2.烧杯250 ml（×1）、150 ml（×2）
3.吸管0.10 ml（×3）、0.5O ml（×3）、1.O ml（×3）、2.O ml（×2)、5.0 ml(×2)。
4.量筒200O ml（×1），250 ml（×1）
5.容量瓶100 ml（×1），250 ml（×1）
6.试管1.5 cm×15 cm（×5）
7.水浴锅
8.电子天平
9.离心机（5000r/min）
10.722型分光光度计
11.UV-9100型紫外可见分光光度计
四、实验试剂
1.3 mol/L 乙醇溶液：量取无水乙醇（比重0.789，相对分子质量：46.07）174.6ml，加蒸馏水稀释100O ml。
2. 0.06 mol/L 焦磷酸纳溶液（pH8.5）：称取焦磷酸纳(Na4P202·1OH20) 22.56g，溶于蒸馏水，稀释至1000 ml。
3. 0.0015 mol/L NAD溶液：称取NAD 0.0995g（NAD相对分子质量: 663.44）溶于蒸馏水并稀释至1000ml。
4. 0.01 mol/L 磷酸氢二钾溶液：溶1.74g K2HPO4于蒸馏水并稀释至100Oml
5.丙酮（A.R.）
6.0.066 mol/L 磷酸氢二钠溶液：溶9.37g Na2HPO4于蒸馏水并稀释至1000ml
五、操作
1. 酵母醇脱氢酶的提纯
（1）粗提
置20g干酵母粉于250ml烧杯中，加0.066mol/L Na2HPO4溶液80ml，37℃水浴锅保温2h，不断搅拌。再于室温提取3h，离心 20min（4000r/min），取上清液2ml，测定蛋白质含量及酶活力，其余上清液量得体积后，倾于150 ml 烧杯中。
（2）热变性沉淀杂蛋白
将上清液55 ℃ 保温15～20 min，不断慢速搅拌。保温毕，立即置冷水中冷却，离心 20 min（4000r/min）。吸取上清液2 ml，测蛋白质含量及酶活力。其余上清液量得体积后,倾于烧杯中。
（3）有机溶剂沉淀杂蛋白
将上清液置盐冰浴中降温至-2℃以下，按100ml上清液加50ml丙酮的比例，加入预先冷至-2℃ 以下的丙酮，边加边搅。加毕，放置片刻，低温离心（0℃，4000r/min）。吸取上清液2ml，测蛋白质含量及酶活力。其余上清液量得体积，倾入已置于盐冰浴的烧杯中。
（4）有机溶剂沉淀酶蛋白
按100ml上清液加55ml丙酮的比例，逐滴加入冰冷之丙酮，使溶液保持-2℃ 以下。待沉淀完全后，低温离心15min（0℃，400O r/min）。弃去上清液，沉淀溶于少量蒸馏水，转移至透析袋内，对冷水透析3h(在冰箱中进行)。离心除去沉淀，上清液即为达到一定纯度的醇脱氢酶制剂（此制剂已无NAD）。
2.蛋白质浓度的测定
吸取1、2、3步骤所取的样液及最后制得的酶制剂0.5 ml，用蒸馏水稀释25～50倍，将5支干试管编以0、1、2、3、4号。0号管作空白试验，加入1.0 ml蒸馏水，其余4管分别加入已稀释的样液或酶制剂1.0 ml，各管均加Folin-酚试剂A 4.0 ml，室温放置10 min， 再加Folin-酚试剂B0.5 ml，摇匀，30min后，比色测定各管A500nm，求得各样液及酶制剂的蛋白质浓度。
3.酶活力测定
样液及酶制剂均需用0.01 mol/L K2HPO4溶液稀释，稀释倍数如下：V（粗提取液）:V（K2HPO4）=1:4；
V（热变性去杂蛋白样液）：V（K2HPO4）=1:9;
V（有机溶剂去杂蛋白样液）：V（K2HPO4）=1:9;
V（酶制剂）：V（K2HPO4）=1:9
吸取0.06 mol/L 焦磷酸钠溶液0.5 ml、3 mol/ L乙醇溶液0.1 ml、0.0015mol/L NAD溶液0.1 ml、蒸馏水2.2 ml 置于石英比色杯中（容量4ml），加入已稀释的样液或酶制剂1 ml，立即混匀，测定A340nm，以后每隔15s测1次，直至A340nm不变，记下反应时间和A340m读数。
于另一石英比色杯中，以蒸馏水代替底物，作空白试验。每分钟A340m增加0.001为1活力。
C=A×B，E=A×D，F=D/B.
4.结果
将测得数据或计算结果填入表。提纯酶时，常用此表，它反映了所采用的每一提纯步骤的效果。
醇脱氢酶的提纯
①本实验比活力=活力单位数/mg蛋白质。
②以NAD为辅酶的醇脱氢酶，它只作用于一级醇、二级醇和半缩醛脱氢,动物醇脱氢酶还能催化环一级醇脱氢、酵母醇脱氢酶无此活性。另有以NADP为辅酶的醇脱氧酶，它只作用于一级醇。
六、思考题
1.简述酵母醇脱氢酶从酵母细胞释放的原理。
2.丙酮沉淀蛋白质的原理。
3.酵母脱氢酶提纯使用了哪些分离纯化方法？