为什么我的重组蛋白没有活性?
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之前给大家说明了详细的原代细胞培养及干细胞培养的相关内容，今天我们来谈谈重组蛋白。
我应如何将
重组蛋白配制为储存液？
数据表中了重新溶解冻干蛋白的说明。
我们推荐首先对盛装冻干蛋白的容器进行离心，以将这些粉末聚集在到管底。大多数蛋白可通过加入无菌蒸馏水来重新溶解。对于100 μg蛋白，所需的溶解加入的水量应在100 µL至1 mL之间，从而形成1 mg/mL至与0.1 mg/mL的蛋白溶液。
如果需要除水以外的其他稀释剂有溶解效果优于蒸馏水的溶剂存在，产品分析表中会对其进行说明。
我应如何保存
重新溶解后的重组蛋白？
溶解后的蛋白可按照工作用量进行分装。工作用量一般在10或20 μL左右。分装后的溶液应可储存于聚丙烯管中。
聚丙烯非常适合此种应用，因为蛋白不会强烈粘吸附于这种材质上。蛋白会粘附玻璃或聚苯乙烯材质，因此我们建议不要使用这些材质的储存容器来储存蛋白溶液。
分装后的溶液可保存于–20°C条件下。如果您有–80°C冰箱可供使用，则这一温度条件更适于储存。
不同表达系统所生成的
重组蛋白间有何主要区别？
Thermo Fisher Scientific™ 所的重组蛋白产品通常在大肠杆菌，昆虫细胞或哺乳动物细胞等不同的表达系统中产生。
不同表达系统之间产生的重组蛋白的主要差别在于这些蛋白所携带的翻译后修饰，如糖基化修饰。在大肠杆菌中生成的重组蛋白未经糖基化。在昆虫细胞中产生的重组蛋白通常经有部分糖基化，但不含半乳糖和唾液脱盐酸，糖链也无复杂分支。在哺乳动物细胞中生成的重组蛋白会发生附带完全的糖基化修饰。
备注：Mimic™ Sf9 昆虫细胞（来源于sf9昆虫细胞系，经改造可稳定表达多种哺乳动物糖基转移酶）可产生用于表达带末端唾液酸和半乳糖的复杂的N-糖链。
为何我的重组蛋白不溶解？
溶解性问题可能由操作不当，或未使用推荐溶剂所导致。我们推荐您在打开试剂管前将冻干粉平衡至室温，并使用产品手册中推荐的缓冲液溶解蛋白产品（某些蛋白在低pH缓冲体系中溶解得更好）。
请勿配制使用蛋白浓度大于1 mg/mL的浓度溶解蛋白产品。请勿剧烈震荡或混合蛋白溶液。将重新溶解的蛋白置于4°C条件下孵育过夜可能有助于解决任何可溶性问题。
为何我的重组蛋白
没有像产品材料中声称的活性？
如果您按照我们产品插页中的描述进行了测试，但未见到任何反应，则可能由以下几种原因导致：
蛋白未按照说明书推荐方式进行溶解。
溶解后的蛋白放置时间过长或蛋白发生沉淀。我们推荐您在重新溶解后的3-6个月内使用这些蛋白产品。
当重新溶解的蛋白溶液浓度低于0.1 mg/mL时，未添加载体蛋白。低于0.1 mg/mL的工作液应立即刻使用；我们不推荐长期储存此浓度的蛋白溶液。
蛋白溶液经过多个次冻融循环或暴露于高温条件下。
使用错误类型的容器操作蛋白（某些蛋白非常容易粘附于某些塑料器皿上）。
为何我在实验中
未检测到重组蛋白的活性？
分析时间至关重要。
每一种分析都需要进行条件优化，并找到在峰值响应的峰值时间进行。不同种类的细胞对于生长因子或细胞因子的响应可能会有差异。
我们建议推荐用户按照产品手册中的推荐方法，使用相同的指示细胞重复我们的质控（QC）分析，来观察是否能够获得类似的反应结果。
此外，血清也可能掩盖细胞的响应。血清剥夺可能适用于某些类型种类的细胞学分析实验可能需要对细胞进行血清饥饿处理。
我收到的装重组蛋白的小管
看上去是空的。这正常吗？
我们的重组蛋白是以冻干粉的形式运送的。
在大多数情况下管中可见蛋白粉末沉淀，有些时候粉末沉淀会脱离原位，粘附在管盖或管壁上。简短短暂的离心就可将蛋白粉末沉淀收集于管底。
不过，并非所有的冻干蛋白均为肉眼可见。在大多数情况下，可见的白色粉末沉淀是原始缓冲溶液中的盐分，管中粉末沉淀多少大小与重组蛋白成份量之间可能并无直接的相关性。
如果重组蛋白在冻干前使用了不含盐分的溶剂，则可能并不容易看到粉末沉淀（通常为透明）。您可通过在SDS PAGE上电泳少量的重溶蛋白重溶液体来确定蛋白的存在。
一般来说，只需在丙烯酰胺胶中上样载入10 ng蛋白，就可清晰地观察到确定预期大小的蛋白条带。
为何某些细胞因子/趋化因子产品
未信息？
如果某项分析中特定细胞因子或趋化因子的反应不是S形反应曲线，则不会信息。
举例来说，许多趋化分析的反应曲线为钟形而非S形（此时，将会有两个浓度能够产生50%的最大响应效果；一个低于最大响应浓度，另一个高于最大响应浓度）。
对于某些细胞因子和趋化因子来说，如果需通过趋化分析来确定生物活性，我们通常一个会引起显著性反应变化的浓度。
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封面图及部分文字图片来自：视觉中国。
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