牛磺鹅去氧胆酸对大鼠脂肪代谢的影响(二)

2 TCDCA对大鼠体重等生理生化指标的影响

２. １试验材料

２.１.１试验动物

清洁级Wistar大鼠，体重155±2ｇ，均为雄性，购买于北京维通利华公司。大鼠维持饲料购买于北京科澳协力公司。

２. １.２试剂与仪器

TCDCA（由本实验室提取，纯度为98.6％）；4％多聚甲醛（大茂试剂厂）；无水乙醇（大茂试剂厂）；二甲苯（大茂试剂厂）；石蜡（华灵康复机械厂）；PBS磷酸盐缓冲液（迈新试剂公司）；苏木精（中杉金桥公司）；中性树胶（中杉金桥公司）。

动物专用血球分析仪BC－2600vet（迈瑞医疗公司）；分析天平1712（德国赛多利斯公司）；全自动生化分析仪日立7020型（日本日立高新技术）；离心机KDC－1042（中科中佳公司）；高压灭菌锅SX－５００（日本Tomy公司）611UF纯水仪（Biotech公司）；恒温水浴箱（HH－420，杰瑞尔电器公司）；－20°Ｃ低温冰箱（海尔公司）；紫外可见分光光度计T6新世纪（北京普析仪器公司）；全自动脱水机（德国莱卡公司）；烤片台（德国莱卡公司）；水浴缸（德国莱卡公司）。

２. ２数据统计与分析

试验结果采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。试验结果用x±Ｓ表示，两个样本均数比较采用ｔ检验，两个以上样本比较采用Ｆ检验，p＜0.05表示差异显著，Ｐ＜0.01表示差异极显著。

２. ３研究内容和方法

２. ３.１TGDGA对大鼠体重及肝脏组织结构的影响

2. ３.１.１动物分组及给药

将36只雄性Wistar大鼠随机分成4组，如表1所示，分别为阴性对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组。阴性对照组以1ｍＬ／100ｇ蒸馏水灌胃大鼠，给药组则采用相同方法分别以不同浓度的TCDCA灌胃大鼠。给药间隔时间为24ｈ且给药21ｄ，每日记录大鼠体重。最后一天给药后禁食但饮水充足，12ｈ后称量其体重，采用心脏采血的方法收集血液，采血直至其失去生命迹象，解剖后采集肝脏、肾、肾周和睾周脂肪^［85］等称重。将采集的肝脏称重，取其最大叶放入10％福尔马林溶液中浸泡24ｈ后更新10％福尔马林溶液。将收集的血液样品放在室温环境静置1－2ｈ，离心后收集血清，置于－20°Ｃ冰箱内保存各用。

２. ３.１.２动物饲养

大鼠饲养于标准大鼠笼中，环境温度适宜，饮水自由且水量充足。每日上午8：00灌胃，每组添加定量且足够的鼠粮，到次日灌胃之前收集并称量剩余鼠粮，计算每组大鼠鼠粮的日摄入量和料肉比。料肉比计算公式如下：

２. ３.１.３脏器与体重比值的测定

大鼠心脏采血直至失去生命迹象，解剖分离整个肝脏和脂肪，称重后计算脏器体重比。计算公式如下：公式：

２. ３.１.４大鼠肝脏组织形态的观察

（１）石蜡包埋

①水洗：将浸泡在4％多聚甲醛溶液的肝脏取出，切割成约0.5ｃｍＸ0.5ｃｍ大小且切面平整的立体块，流动水冲洗过夜。

②脱水：将组织块依次浸入5％0乙醇溶液60min，70％乙醇溶液60min，85％乙醇溶液60min，9％乙醇溶5液１45min，95％乙醇溶液ＩＩ45min，无水乙醇Ｉ４５min，无水乙醇ＩＩ45min。

③透明：脱水完成后将组织块再依次浸入无水乙醇：二甲苯（１:１）一45min，二甲苯Ｉ10min，二甲苯ＩＩ５min。

④浸蜡、包埋：透明完成后将组织块依次浸入过滤好的软蜡６０min，硬蜡60min。浸蜡完成后，将组织块和石蜡倒入准备好的模具中，，赶走组织周围的气泡，待模具里面的石蜡完全凝固后取出蜡块，置于室温保存。

（２）组织切片制作

①修块：将包埋好的蜡块切成大小适宜的小块，且使每一个小石蜡块包含一块组织。将蜡块底部粘接在大小适宜的木块上。

②切片：将蜡块切成均匀的蜡片，蜡片厚度约4ｐｍ，选择厚薄均匀且无皱褶无刀痕的蜡片进行下一步展开。

③展开：将石蜡片放入约42°Ｃ的蒸馏水中展开，用载玻片捞起石蜡片，置于烤片机上烘烤。

（３）HE染色

①脱蜡：组织切片依次浸入二甲苯Ｉ15min，二甲苯ＩＩ15min，二甲苯：无水乙醇（１:１）2min。

②水化：组织切片依次浸入无水乙醇Ｉ、无水乙醇ＩＩ、95％无水乙醇、85％无水乙醇、70％无水乙醇、50％无水乙醇、蒸馏水中均2min。

③染色：将组织切片依次浸入苏木精中染色5min，自来水10ｓ，１％盐酸乙醇2ｓ，自来水1min，蒸馏水1min，50％乙醇、７０％乙醇、85％乙醇、９５％乙醇均2min，0.5％伊红染色液—2min，蒸馏水—１min，95％乙醇３min，无水乙醇Ｉ、ＩＩ均５min，二甲苯Ｉ、ＩＩ均５min。

④封片：中性树胶封片。

２. ３.2TCDCA对大鼠血清生理生化指标的影响

２. ３.２.１血脂水平的检测

将收集好的血液放在室温静置１－2ｈ，３５００ｒ/min离心１０min，分离血清，采用全自动生化分析仪测定所有大鼠血清中总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL-C）、高密度脂蛋白（HDL-C）的含量。

２. ３.２.２血液常规指标的测定

大鼠心脏采血，将全血收集在含有EDTA的抗凝管中，充分摇匀，使血液不发生凝集，取１ML全血，采用动物专用血球分析仪分别检测白细胞数目（WBC）、淋巴细胞数目、单核细胞数目、中性粒细胞数目、淋巴细胞百分比、单核细胞百分比、中性粒细胞百分比、红细胞数目（RBC）、血红蛋白（HGB）、红细胞压积（HCT）、平均红细胞体积（MCV）、平均红细胞血红蛋白含量（MCH）、平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）、红细胞分布宽度变异系数（RDW）、血小板数目（PLT）、平均血小板体积（MPV）、血小板分布宽度（PDW）、血小板压积（PCT）等血液常规指标。

２. ４结果

２. ４.１TCDCA对大鼠体重和增重的影响

大鼠在饲养期间，精神状态良好，食欲正常，排泄正常，无伤病，健康状况良好。由表２可见，与阴性对照组相比，中剂量TCDCA能显著降低大鼠的体重和增重（p＜0.05），提示了中剂量TCDCA可显著抑制大鼠体重以及增重。低、中、高组的料肉比虽较阴性对照组有升高的趋势，但差异不显著（Ｐ＞0.05）。

２. ４.2TCDCA对大鼠脏器体重比值的影响

由表３可知，与阴性对照组相比，低、中、高剂量组大鼠的肾体比、脂肪重量以及脂肪体重比值的差异不显著（p＞0.05）；所有TCDCA给药组中大鼠的肝体比极显著大于阴性对照组（Ｐ＜0.01），从而提示了TCDCA能显著増大大鼠的肝体比，TCDCA虽对大鼠体重有显著抑制作用，对大鼠体内主要贮存脂肪部位的脂肪含量未产生显著影响（p＞0.05）。

２. ４.３TCDCA对大鼠肝脏组织结构的影响

图２为阴性对照组和低、中、高剂量TCDCA组HE染色显微镜下图，A组为200X显微镜下图，Ｂ组为400X显微镜下图。阴性对照组和TCDCA给药组的大鼠肝脏在200X、400X显微镜下其组织结构正常，肝细胞核呈圆形、蓝染，，核中有一个或者多个核仁。肝小叶界限清晰，。肝细胞质均匀红染，无细胞萎缩、脂肪变性等病理现象，表明TCDCA对大鼠肝脏组织形态无显著影响。

２. ４.４TCDCA对大鼠血脂水平的影响

由表４可知，低、中、高剂量组的大鼠血清中TC、TG、HDL-C及LDL-C的含量与阴性对照组相比均未发生显著升高或者降低，即差异不显著（P＞0.05））；但高剂量组的血清中ＴＧ水平显著低于低剂量组（Ｐ＜0.05））。因此表明不同剂量的TCDCA对大鼠血脂水平无显著影响。

2.４.５TCDCA对大鼠血液常规指标的影响

由表５、６、７可知，高剂量组中大鼠血液中淋巴细胞的数目显著高于阴性对照组（p＜0.05），但其数值处于大鼠正常生理范围（2.6-13.5Ｘ10⁹/Ｌ）内。与阴性对照组相比，TCDCA给药组大鼠血液中红细胞、白细胞、中性粒细胞等血液常规指标的数目无显著性差异（p＞0.05））。表明低、中、高剂量的TCDCA对大鼠正常血液常规指标均无显著影响。

２. ５讨论

随着人们物质生活水平的提高，其词养的宠物数量剧增，宠物饮食种类纷繁复杂且营养结构不均衡，导致患肥胖症宠物的数量也不断增加，宠物肥胖症己是较为常见的营养性疾病。肥胖症是指因脂肪过度沉积导致机体机能改变的一种病理状态，由宠物肥胖症所引起的疾病是危害宠物健康的主要因素之一^［87］，现在.认为宠物的肥胖症是世界各国最重要的疾病^［88］。在全美国范围内预估超体重和肥胖的犬和猫从不到25％已上升到50%多；2012年美国预防宠物肥胖协会的调査结果发现，在美国的猫和犬的超体重或肥胖率分别高达58.3％、52.5％^[89］。2008年毛军福等人对我国北京地区2391条犬的调查结果发现，犬的肥胖率为44.4％^［90］；孙玉祝等人的流行病学调查结果表明，北京地区猫的超重率为23％，其肥胖症的发病率为６％^[91］。又有文献报道^[88,92-94]引发宠物患肥胖症最主要原因的是饮食中营养结构的不合理，导致体内营养和能量过多积聚，从而发生肥胖。肥胖可导致脂质代谢紊乱，表现为血清中TG、TC、LDL-C浓度升高，HDL-C浓度降低等^[95］，从而易诱发心血管等疾病。目前对于宠物的肥胖症，大多采用综合性的防治措施，尚无治疗的特效药物。因此，有关控制宠物体重、防止肥胖症的研究对宠物事业的发展具有积极作用。体重指标是人和动物最基本的生理指标也是衡量减肥效果最直接的指标，本实验结果表明，中剂量TCDCA可显著降低大鼠体重，抑制其增重，提示TCDCA有显著降低大鼠体重作用，这为今后研究肥胖治疗奠定了试验基础，并提供了１种可能。据报道，FXR激动剂激活FXR后，可显著降低高脂肪膳食诱导的肥胖模型大鼠和正常大鼠的增重率这与本实验结果相一致。因而提示了TCDCA可能通过激活FXR影响大鼠增重率。但TCDCA对肥胖模型大鼠是否具有抑制其肥胖作用，有待于进一步研究。

TC是存在于血液中所有胆固醇的总和，主要是在肝脏合成以及贮存。TG是人和动物体内含量最多的脂类，肝脏、脂肪等组织是TG的主要合成场所，TC和TG是临床血脂分析的重要指标，二者的升高，能增加人和动物患心脑血管疾病的风险HDL-C与高密度脂蛋白受体结合后可减少细胞内源性胆固醇合成，起到清除细胞内脂肪的作用^[97]，TCDCA给药组的大鼠血清中TC、TG、HDL-C及LDL-C均与阴性对照组比无显著变化，从而提示了TCDCA对大鼠血脂的正常水平无显著影响。

有研究报道，将CDCA灌注于十二指肠后，十二指肠中成纤维生长因子１９（FGF19）的分泌量显著升高，最终使肝脏功能得到改善^[98］。用0.2％CA词喂野生型小鼠持续５ｄ，结果显示CA显著增大小鼠肝脏的重量，肝体比增加约３０％，但未对小鼠产生毒性作用^［99]。这与本研究结果较为一致，TCDCA极显著增大大鼠的肝体比。引起肝脏重量的显著增加可能有两种原因：第一，TCDCA引起肝脏病理性增大，如引起炎症、水肿、细胞癌变等病理过程；第二，TCDCA能促进肝细胞增殖分化，增强肝脏生理功能。文献资料显示，胆汁酸可以激活FXR，FXR被激活后对肝切除模型中肝细胞的增殖起促进作用，又可通过对肝脏能量代谢过程的调控刺激肝脏再生，从而在一定程度上起到保护肝脏的作用另外，FXR的激活不仅能诱导负反馈途径保护肝脏细胞免受胆汁酸的毒性作用，又能通过促进肝脏生长增强肝脏应对超负荷的能力^［99］。

脂肪代谢发生的主要场所是在肝脏，本课题实验结果显示TCDCA极显著增大大鼠肝体比，为了探究肝体比增大的原因是否由TCDCA毒性作用所致，本实验采用HE染色观察大鼠肝脏的组织形态和细胞结构。文献资料显示，非结合型胆汁酸DCA、LCA、CDCA以及结合型胆汁酸 GCDCA 和TCDCA损害从大鼠肝脏中线粒体功能，这可能在一定程度上介导细胞毒性^［101］。CDCA能诱导某些动物发生胆汁性肝硬化，且具有几分肝毒性，也能呈剂量依赖性引发人腹泻由于TCDCA具有细胞毒性的特点，TCDCA被用来诱导胆汁淤积从而建立肝损伤动物模型^[103]，但其剂量高于本实验所用TCDCA的最高剂量，且TCDCA纯度不同。本实验结果显示，低、中、高剂量TCDCA组的大鼠肝脏组织形态和细胞结构与阴性对照组无差异，所有肝脏的组织形态和细胞结构均正常且清晰，提示了TCDCA对大鼠肝脏组织形态和细胞结构未产生毒性作用，也未引起大鼠肝脏组织形态学病变，从而证实了TCDCA显著增大大鼠肝体比属非不良反应。

据报道，肝细胞有很强的增殖能力，成熟肝脏生长的起始和终止由一种机制控制，这种机制可以维持肝脏适当的大小，胆汁酸参与调节这种机制；肠道FXR/FGF１５激活后可降低胆汁酸的合成水平，从而保护肝脏免受胆汁淤积引起的损伤，因此表明FXR具有保护肝脏的作用^[104]。胆汁酸能通过影响FXR和TGR5的表达量，调控FXR和TGR5介导的肝再生信号转导通路，促进肝细胞增殖，抑制肝细胞凋亡^[105]。因此，TCDCA引起肝体比显著增加可能与其调控FXR和TGR5介导的肝再生信号转导通路有密切的联系。FXR既与肝脏再生、肝细胞增殖关系密切，又参与调控脂肪代谢等能量代谢，为此本研究开展了TCDCA对肝脏FXR受体表达影响的研究。

2.６小结

中剂量TCDCA可显著降低大鼠体重，抑制其增重；TCDCA对大鼠肝体比有显著增大作用；TCDCA对大鼠肝脏组织形态无病理性影响。