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Notch 信号通路在银屑病发病中的作用机制研究方法

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银屑病是一种常见的慢性炎症性皮肤病,其主要病理特征为角质形成细胞过度增殖,导致表皮可凋亡的角质形成细胞异常分化,并伴随皮肤炎症浸润及血管生成异常等银屑病病程较长易复发且较难治愈。目前关于银屑病的发病原因和机制尚无定论,但普遍认为与遗传和环境相关Notch 信号通路由多种分子及蛋白组成,参与多种疾病的发生过程,与银屑病的发生密切相关。目前研究较多的是 Notch 信号通路与免疫介导机制在银屑病发病中的作用 角质形成细胞是构成表皮结构的主要细胞,约占表皮细胞总数的 80% 多种皮肤肿瘤及炎症性皮肤病的发生与角质形成细胞增殖、凋亡、分化异常相关 HaCaT 细胞是从成人皮肤中分离的永生化角质形成细胞系,其遗传特性稳定,增殖、分化特性与角质形成细胞相似,在进行实验研究时常用来替代角质形成细胞。2014 4月 ~ 2015 年 6 月,本研究观察 Notch 信号通路关键因子在银屑病皮损区皮肤中的表达情况及对 HaCaT

 

细胞增殖、凋亡及分化的影响,探讨 Notch 信号通路在银屑病发病中的作用机制。

 

材料与方法

 

1. 1 皮肤组织标本来源 选择同期山东省中医院就诊的斑块型银屑病患者 30 ( 病例组) ,均经皮肤组织病理检查确诊。其中男 18 例、 12 例,年龄18 ~ 75( 32. 6 ± 7. 4) 岁。采集患者皮损区皮肤组织为病例组,同时采集距皮损区 1 cm 非皮损区皮肤组织作为对照组。纳入标准: 皮损区近 2 周未外涂药物,近 1 个月未接受免疫抑制剂及其他药物治疗。排除标准: 年龄 < 18 岁或  75 ; 合并皮肤肿瘤或其他增生性皮肤病; 有心脑血管、肝、肾及造血系统等严重原发性疾病或其他情况不适合取材者。同期选取本院皮肤科留存的健康人皮肤组织样本 30 例作为正常组,健康人男 16 例、女 14 例,年龄 18 ~ 69

 

( 34. 2 ± 6. 8) 岁。三组性别、年龄比较差异无统计学意义( P 均 > 0. 05) 。三组去除皮下结缔组织与皮下脂肪后,于液氮中速冻,- 80 冰箱中保存备用。

 

1. 2细胞、试剂及仪器人永生化角质形成细胞系 HaCaT,购于中国科学院细胞库。Notch 信号通路特异性激活剂( Jagged1-Fc 融合蛋白) 和 Notch 信号通路特异性阻断剂( DAPT) ,购于美国 R&D System 公司; TRIzol、逆转录试剂盒、荧光定量试剂 ( SYBR Green I) ,购于日本 TaKaRa 公司; Notch1、Jagged1、B淋巴细胞瘤 / 白血病-2 ( Bcl-2 ) 、Bcl-2 相关 X 蛋白 ( Bax) 、角蛋白 1 ( Keratin1) 和重组人外皮蛋白( In-volucrin) 单克隆抗体,购于美国 Abcam 公司; 辣根过氧化物标记的二抗,购于北京中杉金桥生物技术有限公司; DMEM 培养基、100 μg / mL 碘化丙啶( PI) 、Annexin-V-FITC,购于美国 Sigma 公司; MTT 试剂盒购于普洛麦格北京生物技术有限公司; BCA 蛋白定量试剂盒、5 × SDS 蛋白上样缓冲液,购于天根生化科技有限公司; FBS,购于杭州四季青生物工程材料研究所。CO2 培养箱,购于常州菲普实验仪器厂; 倒置显微镜,购于日本尼康; RT-PCR 仪,购于瑞士Roche 公司; 流式细胞仪,购于美国 BD 公司; Multi-skan MK3 型酶标仪,购于芬兰 Thermo Labsys2tems公司。

1. 3细胞培养及处理从液氮罐中取出装有HaCaT 细胞的冻存管,放入 37恒温水浴锅中快速解冻,待细胞冻存液融解后,将细胞移至 5 mL 无菌离心管中,加入含有 10% FBS 的 DMEM 培养液

3 mL稀释冻存液中的 DMSO,1 000 r / min 离心

5 min,去除上清液。加入新的培养液吹打重悬细胞沉淀,接种到细胞培养皿中,置于 37 ,5% CO2 培养箱中培养。细胞贴壁后换液 1 次,去除漂浮的死细胞,之后定期换液,待细胞融合度达 80% 以上时,用0. 25% 的胰酶消化并收集细胞,按 1 3 的比例进行传代培养。取对数生长期的 HaCaT 细胞,去除细胞培养液,用 PBS 清洗细胞 2 次,用 0. 25% 的胰酶消化,待细胞呈单个存在时终止消化,离心收集细胞沉淀。用培养液重悬、计数后,将细胞浓度调整为 5 × 104 / mL,每孔 200 μL 接种于经紫外照射灭菌的96 孔培养板中,置于 375% CO2  培养箱中培养24 h后,去除细胞培养液,将细胞随机分为 Jagged1-Fc 融合蛋白组、DAPT 组、常规对照组,分别加入含 ( 终浓度 0、0. 5、1、2 μg / mL) Jagged1-Fc 融合蛋白、 ( 终浓度 0、5、10、20 μmol / L) DAPT、常规细胞培养液进行培养

 

1. 4皮肤组织中 Notch1、Jagged1 mRNA 表达检测

用RT-PCR 技术。取三组皮肤组织,用 TRIzol 法提取总RNA。紫外分光光度计检测总 RNA 浓度,琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA 质量; 用 PrimeScriptTM RTReagent kit 逆转录试剂盒合成将 RNA 逆转录成cDNA,用 RT-PCR 试剂盒检测。根据 GenBank 数据库中公布的人 Notch1 和 Jagged1 mRNA 序列,用Primer5. 0 软件设计 RT-PCR 引物,送上海派森诺生物科技有限公司合成,引物序列为 Notch1-F: 5'-GT-CAACGCCGTAGATGACCT-3',Notch1-R: 5'-CAGGTT-GTACTCGTCCAGCA-3';Jagged1-F:  5'-GTCCCACTG-GTTTCTCTGGA-3',Jagged1-R:  5'-CCACAGACGTTG-GAGGAAAT-3';  β-actin-F: 5'-TGACGTGGACATCCG-CAAAG-3',β-actin-R: 5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAG-G-3'。RT-PCR 扩增条件: 预变性 95 5 min,变性 95 30 s,退火 60 30 s,延伸 72 30 s35 个循环。 β-actin 作为内参,采用 2  Ct 法计算目的基因相对表达量。

 

1. 5皮肤组织中 Notch1、Jagged1 蛋白及 HaCaT 细胞内 Bcl-2、Bax、Keratin1、Involucrin 蛋白表达检测采用 Western blotting 法。取三组皮肤组织,按照蛋白提取试剂盒说明书提取皮肤组织总蛋白; HaCaT细胞 Jagged1-Fc  白、DAPT  理。0. 25% 的胰酶消化、收集细胞,按照蛋白提取试剂盒说明书提取 HaCaT 细胞总蛋白。按照试剂盒说明书测定组织及细胞总蛋白浓度。蛋白上清液稀释至统一浓度后,与 Loading buffer 按体积 4 1 混匀,100煮沸 5 min 使蛋白变性。将变性蛋白样品加入SDS 蛋白凝胶上样孔中,每孔 50 μL,常规方法垂直电泳。电泳结束取出蛋白凝胶,按照滤纸、PVDF膜、蛋白凝胶、滤纸的顺序在 4转膜过夜。PBST洗涤 3 次,PVDF 膜用 5% 脱脂奶粉封闭 2 h,然后依次与一抗( 500 倍稀释) 、二抗( 1 000 倍稀释) 孵育,滴加 ECL 显色液,在暗室中曝光,用 Odyssey 成像系统扫描各条带灰度值,β-actin 条带作为内参照。目的蛋白相对表达量 = 目的蛋白灰度值 / β-actin 灰度值。

 

1. 6HaCaT 细胞增殖活力检测采用 MTT 法。

HaCaT 细胞经 Jagged1-Fc 融合蛋白、DAPT 处理,置于 37 、5% CO2 培养箱中培养 24、48、72 h,每孔加入 0. 5% 的 MTT 溶液 20 μL,继续培养 4 h,弃去培养液,加入 DMSO 150 μL,低速振荡 10 min 溶解蓝紫色结晶。用空白调零孔调零,用酶标仪测定波长 570 nm 处光密度 ( A) 值,A 值与细胞数量呈正比,以 A 值作为评价细胞增殖活力的指标。

1. 7HaCaT 细胞凋亡率检测采用流式细胞术。

取对数生长期的 HaCaT 细胞分别用终浓度为 2 μg /mL 的 Jagged1-Fc 融合蛋白、终浓度为 20 μmol / L DAPT 处理 72 h,弃去细胞培养液,PBS 清洗细胞 2次,加入 0. 25% 的胰蛋白酶消化、收集细胞,以不做处理的细胞作对照。细胞计数,用细胞培养液重悬细胞,调整细胞为 1 × 106 / mL。取细胞悬液 1 mL 加入 1. 5 mL 离心管中,41 200 r / min,离心 5 min,弃上清液。向细胞沉淀中加入 Binding Buffer 200μL,充分混匀后分别加入 PI 5 μL Annexin V-FITC 5 μL,避光室温孵育 20 ~ 30 min,加入 Binding Buffer 400 μL,用流式细胞仪检测 HaCaT 细胞凋亡情况,计算细胞凋亡率。

 

1. 8统计学方法采用 SPSS21. 0 统计软件。计量资料用 x珋± s 表示,比较采用单因素方差分析或重复测量方差分析,进一步两两比较采用 LSD-t 检验。P < 0. 05 为差异有统计学意义



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