【学科前沿】玉屏风散对支气管哮喘小鼠微小RNA表达的影响

文明微小ＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ，ｍｉＲＮＡ）是一类长约22个核苷酸序列的非编码ＲＮＡ，通过核苷酸序列与特定的靶ｍＲＮＡ互补配对，抑制靶基因的转录或降解靶ｍＲＮＡ，进行基因表达调控，从而影响蛋白质合成。ｍｉＲＮＡ参与生物的多种生理活动的调节，包括肿瘤的发生、自身免疫性疾病、病毒感染等情况。

       研究已证实，ｍｉＲＮＡ也参与支气管哮喘（哮喘）发病机制中不同免疫通路的调控。本研究检测ｍｉＲ-１４６ａ、ｍｉＲ-１４６ｂ、ｍｉＲ-２１０、ｍｉＲ-１２６和ｍｉＲ-２１ａ的表达，观察玉屏风散通过对哮喘ｍｉＲＮＡ的调控来调节相关Ｔｈ细胞的机制。

１　材料与方法　

１．１　材料

１．１．１　实验动物　

       １２周龄ＳＰＦ级雄性ＢＡＬＢ／ｃ小鼠（相当于人类４．２９岁）４０只，体质量（１８．２６±１．２６）ｇ，购自上海Ｓｌａｃｋ实验动物有限公司。饲养在ＳＰＦ级动物实验室（许可证号：ＳＹＸＫ［沪］２０１０－００９９），清洁饲料喂养。

１．１．２　主要试剂和药物主要试剂　

       卵清蛋白（ＯＶＡ，Ⅳ级）为美国Ｓｉｇｍａ公司产品，Ｔｒｉｚｏｌ试剂购自美国Ｉｎｖｉｔｒｏ-ｇｅｎ公司，反转录ＰＣＲ（ＲＴ-ＰＣＲ）（ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ）试剂盒购自伯乐生命医学产品（上海）有限公司（批号：＃１７２５２６１），反转录试剂盒购自美国Ｔｈｅｒｍｏ公司（批号：＃Ｋ１６２２）。药材购自上海养和堂中药饮片有限公司，黄芪（批号：１２１００９）；白术（批号：１２０８０６），防风（批号：１２０９２８）。白细胞介素（ＩＬ）-１３和ＩＬ-１７抗体ＥＬＩＳＡ试剂购自美国ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ公司。蛋白定量检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所。玉屏风散水煎剂按《丹溪心法》的传统玉屏风散方剂标准配伍。按文献方法运用微波技术提取水煎剂，水煎剂含玉屏风散生药１０４．８６ｇ／Ｌ。

１．２　方法

１．２．１　小鼠哮喘模型建立　

       Ｂａｌｂ／ｃ小鼠致敏方法参照ＭｃＣｕｓｋｅｒ等的方法。即实验第０、７、１４天分别腹腔注射４ｇ／ＬＯＶＡ混悬液０．２ｍＬ，第２１天起用４ｇ／ＬＯＶＡ溶液５０μＬ每天滴鼻１次，连续激发７ｄ。正常对照组用９ｇ／Ｌ氯化钠溶液等容量体积替代ＯＶＡ溶液。

１．２．２　分组　

       按照随机数字表法将４０只小鼠分为４组：正常对照组、哮喘模型组、玉屏风散治疗组和地塞米松治疗组。正常对照组和哮喘模型组分别于激发结束的次日（实验第２８天）腹腔注射０．２ｍＬ９ｇ／Ｌ盐水；玉屏风散治疗组：腹腔注射玉屏风散水剂（生药含量０．４ｇ／ｋｇ）；地塞米松治疗组：腹腔注射地塞米松（２ｍｇ／ｋｇ）。每天１次，连续７ｄ。

１．２．３　肺组织匀浆和脾脏标本制备　

       小鼠腹腔注射钠（４０ｍｇ／ｋｇ）麻醉后，用眼科剪剪开腹部皮肤，暴露腹腔，至左侧腹腔钝性分离脾脏，取脾脏于器皿中，按体积１：９加入Ｔｒｉｚｏｌ试剂，置－２０℃冰箱，２ｈ后置－８０℃冰箱保存待测ｍｉＲＮＡ。左肺组织用于匀浆制作，按组织细胞悬液制作方法制备，用４℃ ９ｇ／Ｌ盐水３ｍＬ稀释，并立即置－２０℃冰箱，２ｈ后将悬液置－８０℃ 冰箱保存待检相关细胞因子。

１．２．４　肺组织病理检查　

       经腹腔向胸腔钝性分离，暴露气管后作气管固定。取右肺组织，置４０ｇ／Ｌ中性甲醛固定液固定２４ｈ，常规石蜡包埋、切片３μｍ，ＨＥ染色，光镜观察。

１．２．５　肺组织匀浆细胞因子测定　

       ４０００ｒ／ｍｉｎ（离心半径为１０ｃｍ）离心１５ｍｉｎ，取上清液待测。先行蛋白定量测试，操作方法按南京建成生物工程研究所的说明书进行，统计肺组织匀浆蛋白水平，对肺组织匀浆进行组织浓度相对标准化处理。ＩＬ-１３和ＩＬ-１７ＥＬＩＳＡ检测操作方法步骤按ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ公司产品说明进行。

１．２．６　脾组织ｍｉＲＮＡ测定　

       ＲＮＡ的抽提、反转录ｃＤＮＡ、实时定量ＰＣＲ（ｑＲＴ-ＰＣＲ）扩增均由上海基尔顿基因公司完成。引物设计和合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成。反向通用引物Ｒ：５′-ＡＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧ-ＧＡＧＴＣＧＧＣ-３′。小鼠源（ｍｍｕ）-ｍｉｒ-１２６：ＲＴ引物：５′-ＣＴ-ＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧＴＧＡＣＣ-ＧＣＧ-３′；上游引物：ＴＧＡＣＡＧＣＡＣＡＴＴＡＴＴＡＣＴＴＴＴＧ。ｍｍｕ-ｍｉｒ-２１ａ：ＲＴ 引物：５′-ＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＧＴ-ＣＧ-ＧＣＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧＧＡＴＡＣＣＡＡ-３′；上游引物：ＴＧＴＡＣ-ＣＡＣＣＴＴＧＴＣＧＧＡＴＡＧＣＴ。ｍｍｕ-ｍｉｒ-２１０：ＲＴ引物：５′-ＣＴ-ＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧＧＧＴＴＣ-ＧＣＧ-３′；上游引物：ＣＴＧＧＴＡＧＧＣＣＧＧＧＧＣＡＧＴＣ。ｍｍｕ-ｍｉｒ-１４６ａ：ＲＴ 引物：５′-ＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＧＴＣＧ-ＧＣＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧＡＧＣＴＧＡＡＧ-３′；上游引物：ＡＧＣＴＣＴ-ＧＡＧＡＡＣＴＧＡＡＴＴＣＣ。ｍｍｕ-ｍｉｒ-１４６ｂ：ＲＴ 引物：５′-ＣＴ-ＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧＧＡＴＧＧ-ＴＡＴ-３′；上游引物：ＧＡＣＴＧＡＧＡＧＡＡＣＴＴＴＧＧＣＣＡＣ。内参５Ｓ：上游引物：ＣＣＡＴＡＣＣＡＣＣＣＴＧＧＡＡＡＣＧＣ；下游引物：ＴＡＣＴＡＡＣＣＧＡＧＣＣＣＧＡＣＣＣＴ。

１．３　统计学处理　

       采用ＳＰＳＳ１３．０软件进行数据分析，数据以±ｓ表示，组间结果比较采用Ｏｎｅ-ＷａｙＡＮＯＶＡ方法，２组间均数比较采用独立样本ｔ检验，Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。样品目的ｍｉＲＮＡ和内参（５Ｓ）ＲＴ-ＰＣＲ数据采用ΔＣｔ值方法进行分析，结果用表示。

２　结果　

２．１　肺组织匀浆ＩＬ-１３和ＩＬ-１７水平测定结果　

       玉屏风散对哮喘模型组ＩＬ-１３有显著的抑制作用（ｔ＝３．７８５，Ｐ＝０．００５），地塞米松治疗组亦有抑制作用（ｔ＝２．７７９，Ｐ＝０．０２４）。而玉屏风散治疗组与地塞米松治疗组间差异无统计学意义。玉屏风散与地塞米松治疗对ＩＬ-１７也有显著的抑制作用（分别为：ｔ＝９．８９１，Ｐ＝０．０００；ｔ＝６．２２５，Ｐ＝０．０００）。结果见表１。

２．２　肺组织病理检查结果　

       与正常对照组比较，哮喘模型组可见终末呼吸道为假复层柱状上皮细胞，部分上皮呈状增生，伴小血管和毛细血管充血，间质下大量炎性细胞浸润。玉屏风散治疗组仍有部分肺泡轻度不张，呼吸道上皮细胞增生改善，黏膜下炎性细胞浸润显著减少，仍见少量小血管和毛细血管充血。地塞米松治疗组病理状况基本得到改善（图１）。

２．３　脾组织ｍｉＲＮＡ测定结果　

       小鼠脾组织ｍｉＲ-２１０和ｍｉＲ-１２６各组间差异均有统计学意义，ｍｉＲ-２１ａ、ｍｉＲ-１４６ａ和ｍｉＲ-１４６ｂ组间差异无统计学意义（表２）。哮喘模型组ｍｉＲ-２１０表达略低于正常对照组，玉屏风散治疗组ｍｉＲ-２１０为哮喘组３．９５倍（ｔ＝２．７１８，Ｐ＝０．０２６），但地塞米松治疗组与哮喘模型组差异无统计学意义。玉屏风散治疗组和地塞米松治疗组ｍｉＲ-１２６表达均高于哮喘组（分别为：２．１５倍，ｔ＝２．４０５，Ｐ＝０．０４３和４．４８倍，ｔ＝－３．０６９，Ｐ＝０．０１５），但均低于正常对照组，其中玉屏风散治疗组与正常对照组差异有统计学意义（０．３３倍，ｔ＝－３．７３３，Ｐ＝０．００６），而地塞米松治疗组与正常对照组差异无统计学意义。哮喘模型组ｍｉＲ-２１ａ表达略高于正常对照组，玉屏风散治疗组ｍｉＲ-２１ａ高于其他各组，与地塞米松治疗组差异有统计学意义（２．７５倍，ｔ＝－２．６３５，Ｐ＝０．０３０），玉屏风散治疗组ｍｉＲ-２１ａ表达显著高于地塞米松治疗组。虽然小鼠脾组织ｍｉＲ-１４６ａ和ｍｉＲ１４６ｂ的表达差异无统计学意义，但哮喘模型组与正常对照组相比ｍｉＲ-１４６ａ表达上调，而ｍｉＲ-１４６ｂ表达下调，玉屏风散治疗组和地塞米松治疗组均能改善ｍｉＲ-１４６ａ和ｍｉＲ-１４６ｂ的表达异常，并接近于正常对照组的表达水平，见表２。

３　讨论

       哮喘是由多种炎性细胞，包括嗜酸性粒细胞、肥大细胞、Ｔ淋巴细胞、中性粒细胞参与的呼吸道慢性炎性疾病。哮喘的发生是遗传与环境因素共同作用的结果，其发病机制目前尚不完全清楚。哮喘是多基因疾病。广东地区多中心、大样本对照研究了ＯＲＭＤＬ３基因单核苷酸多态性（ＳＮＰ）对哮喘患儿的发病影响。结果显示，ＯＲＭＤＬ３基因ＳＮＰｒｓ１２６０３３３２各基因型与哮喘家族史、呼吸道病毒感染史均显著相关。

       本实验采用ＯＶＡ诱导哮喘模型，即ＯＶＡ腹腔注射致敏及滴鼻激发。哮喘模型组肺部存在炎性反应和呼吸道上皮细胞病变，肺组织匀浆测定ＩＬ-１３和ＩＬ-１７水平也证实哮喘模型组存在炎性反应，玉屏风散和地塞米松均能抑制这些炎性因子。与本课题组既往实验结果一致，也与王慧珠等报道一致。本研究主要探讨玉屏风散对Ｔｈ细胞的作用与ｍｉＲＮＡ表达的关系。

       ｍｉＲ-１４６有２个亚型：ｍｉＲ-１４６ａ和ｍｉＲ-１４６ｂ。Ｆｅｎｇ等研究指出，哮喘激发后，ｍｉＲ-１４６ａ表达水平升高，５ｄ后可降至对照组的表达水平。然而Ｍｏｎｔｉｃｅｌｌｉ等对小鼠造血干细胞系统的研究显示，ｍｉＲ-１４６参与ｎａiｖｅＴ淋巴细胞向Ｔｈ１分化，在Ｔｈ１细胞参与的炎性反应过程中高表达。Ｔｓｉｔｓｉｏｕ等研究指出严重哮喘与ＣＤ８＋细胞激活有关，而ｍｉＲ-１４６ａ／ｂ的下调可能参与对ＣＤ８＋细胞激活的调节。ｍｉＲ-１４６参与调控Ｔｈ细胞的研究结果存在分歧，目前尚无定论。本实验中，哮喘模型组ｍｉＲ-１４６ａ和ｍｉＲ-１４６ｂ与２个治疗组间差异无统计学意义，但与正常对照组比较ｍｉＲ-１４６ａ表达上调，ｍｉＲ-１４６ｂ表达下调，可能与本研究小鼠哮喘模型采用单纯ＯＶＡ作为变应原诱导方案有关。玉屏风散与地塞米松对ｍｉＲ-１４６ａ和ｍｉＲ-１４６ｂ的表达均无显著作用。

       Ｗｕ等研究显示，哮喘模型组小鼠的ｍｉＲ-２１显著增高，而ＩＬ-１２和信号传导及转录激活因子４（ＳＴＡＴ４）蛋白水平明显低于正常对照组和地塞米松治疗组。提示ｍｉＲ-２１与抑制ＩＬ-１２和ＳＴＡＴ４通路有关。Ｌｕ等指出敲除ｍｉＲ-２１基因的小鼠采用ＯＶＡ诱导的方案，激活了ＩＬ-１２／γ-干扰素（ＩＦＮ-γ）通路，通过增加ＩＦＮ-γ和抑制ＩＬ-４调节Ｔｈ１／Ｔｈ２的平衡，能抑制迟发型超敏反应的严重程度。本实验中，地塞米松可抑制ｍｉＲ-２１ａ表达，但差异无统计学意义。玉屏风散治疗组ｍｉＲ-２１ａ表达高于哮喘模型组，实验结果与Ｌｕ等报道结果相反，提示玉屏风散治疗作用并非通过激活Ｔｈ１通路。

       在机体缺氧的情况下，ｍｉＲ-２１０起重要的调节作用，Ｗａｎｇ等指出缺氧情况下ｍｉＲ-２１０可抑制缺氧诱导因子１α（ＨＩＦ-１α）表达，ＨＩＦ-１α是Ｔｈ１７细胞极化的一个关键转录调节因子，去除ｍｉＲ-２１０可促进Ｔｈ１７细胞的分化。本结果显示，玉屏风散能显著提高ｍｉＲ-２１０的

表达，提示玉屏风散可能在哮喘缺氧的情况下，通过对Ｔｈ１７细胞分化和对Ｔｈ２细胞的抑制起治疗作用，而地塞米松无类似作用。

       有研究表明，ｍｉＲ-１２６与ＣＤ４＋Ｔ淋巴细胞亚群活化有关，细胞内外均可表达，与Ｔｈ１７细胞的成熟分化密切相关。Ｓｕｏｊａｌｅｈｔｏ等研究发现持续哮喘患者中，ｍｉＲ-１２６表达下调。本结果亦显示，玉屏风散治疗组和地塞米松治疗组ｍｉＲ-１２６表达水平显著高于哮喘模型组，提示玉屏风散和地塞米松对调控ｍｉＲ-１２６表达是治疗哮喘的共同作用机制之一。

       玉屏风散是中医的一个经典方剂，已使用７００多年，现临床常用于儿童哮喘治疗。本研究测定了５种与Ｔｈ细胞有关的ｍｉＲＮＡ，结果表明，玉屏风散可能通过ｍｉＲ-２１０和ｍｉＲ-１２６对Ｔｈ１７细胞分化成熟以及对Ｔｈ２细胞活化抑制起调节哮喘免疫状况的作用，与玉屏风散对ＩＬ-１３和ＩＬ-１７的抑制作用以及病理状况的改善相一致。因此，ｍｉＲＮＡ可能是治疗哮喘的新药物靶点，同时中医药治疗对ｍｉＲＮＡ的调节和补充可能是今后研究的新方向。

来源：中华实用儿科临床杂志２０１６年２月第３１卷第４期