具有学科特色的消化系疾病生物样本库(中文文献交流)

生物样本库BS小组

原文刊发于《转化医学杂志》2015年8月第4卷第4期 ，经作者授权转载。

摘要：

随着个体化治疗和转化医学的发展，生物样本库作为临床与科研转化间的桥梁，越来越受到人们的重视，以至越来越多的单位投入到了生物样本库的建设大潮中。 但在众多的建设中也出现了一些问题和隐患，包括缺乏统一的建设标准（求量忘了质）、资源利用率不足（求存不求用）。 在消化系疾病生物样本库建设过程中建立了严格可行的质量体系，质量控制方案贯穿于样本的收集、整理、入库、应用以及有计划地随机抽检等各个环节，以保证样本的质量；同时，消化系疾病生物样本库也把样本的信息建设作为重要建设内容，除了让样本具备完整的临床信息，还重视随访信息与科研数据信息的更新完善与反馈收集。 西京消化病医院初步建立了较高“综合质量”的消化系疾病生物样本库，满足了临床、科学研究的许多需求，发挥了消化系疾病临床与科研转化的桥梁作用。

关键词：生物样本库；消化系疾病；质量控制；信息化管理；随访信息

随着科学技术的发展，人们对疾病的发病机制有了深刻的认识，但是却不能很好地应用于临床预警、诊断和治疗，一个非常重要的原因是基础研究和临床研究没有建立真正的交流和合作[1] 。 不可再生的生物样本既包含了丰富的基础研究信息（研究所需样本实体及遗传信息）， 也包含了临床研究的信息（疾病进展和疗效），一直担当着基础研究和临床研究的桥梁和纽带作用， 而备受关注 。2011年，国家十二五规划明确将“系统建设临床样本资源库” 列为 “ 支撑医学发展 ”的重要工作之一[2] 。

第3次全国死因回顾抽样调查报告显示，我国的恶性肿瘤发病率和病死率均高于全球平均水平，并且以年3％～5％的速度递增[3] ，特别是食管癌、胃癌、肝癌和结直肠癌等消化系肿瘤的病死率占肿瘤死亡总数的 40.75％ [4] 。 因此，消化系肿瘤的治疗与研究尤为重要。 而高标准的生物样本是临床研究与基础研究的宝贵资源，是转化医学研究的基石[5] 。为了满足临床与科学研究的需要，西京消化病医院立足于医院丰富的临床资源，成立了消化系疾病生物样本库，目标是研究以消化系肿瘤为主的消化系疾病的发病机制，探讨有效的预警、早期诊断和临床治疗方案以及降低其发病率和病死率。

1 简介

消化系疾病生物样本库依托单位为第四军医大学西京消化病医院，医院专注于消化系疾病的临床治疗与基础医学研究，是集临床、教学、科研为一体的综合医院，连续5年在全国消化病医疗系统中排名第1。 首先，丰富的临床资源是消化系疾病生物样本库建立的基础。 医院拥有门急诊、内镜中心、手术室、监护室、临床检验室、病理室、10个病区、临床试验基地，年门急诊量 40 余万人次，各部门的高效、充分协作保证了样本的高质量。 其次，强大的科研与转化能力是消化系疾病生物样本库运行的“发动机”。 医院拥有肿瘤生物学国家重点实验室，承担国家级科研项目104项，总资助金额达11630 万元。大量课题的承担与获得为样本库的运行指明了建设方向，也提供了充足的经费支持（图1）。

图1：以应用转化为主导的建设模式

医院消化系疾病生物样本库经过几年的发展，已初步形成标准化、规范化的样本采集、储存和管理体系，同时取得了一定的成果。消化系疾病生物样本库有先进的样本采集、转移、储存和自动化的温控系统等硬件以及专业的样本库管理软件。 在存储设备方面配置了低温冰箱、超低温冰箱、超大型液氮罐，总计可存储容量达45万份，现完整保存临床消化系疾病相关的样本达136584 份，高危流行病区疾病普查样本46697 份（来自于胃癌高发地甘肃省武威市的 29 个抽样调查点）。 所有样本均有完善的临床资料或流行病学调查信息，以及不断更新的随访信息。

2 高质量特色样本库

具有完整临床信息的高质量生物样本是 21 世纪个体化医疗时代的关键，是系统研究多种生命组学的基础[6]，是样本库建设的核心内容。 西京消化病医院消化系疾病生物样本库在樊代明院士“精品战略”思想的指导下，始终把样本的质量放到第1位。 样本库把实体样本的质量与样本对应的信息质量2个方面同时进行建设。

2.1  质量管理体系  为了保证样本的质量，西京消化病医院消化系疾病生物样本库参照国内外的标准化建设指南[7-10] ，建立了符合消化系疾病特色的样本处理与质量控制的最佳实践方案；已建立和完善了质量手册、程序文件、作业指导书和记录等4个层次的系统文件；制定了包括样本采集、运输、处理、储存、进出库等操作流程质量控制方案，以及样本抽检质量控制方案。

2.1.1　样本采集和处理  临床样本的采集是在不额外增加患者痛苦、不影响病理诊断和临床检查的前提下进行。 采集过程严格执行本样本库相关标准作业程序。 样本库主要收集血液样本和组织样本。

2.1.1.1　血液  血液样本从采集到入库的整个过程在2ｈ 内完成。 血液采集在护士站或检验科，用抗凝管和促凝管分别采集血液各1 管，然后由专门的工作人员在最短的时间内送至样本库，室温放置30min 后，2500g 15min离心，多管分装（4 小管2大管），入库保存血样（短期存放的样本在-80℃冰箱中保存，长期或者重要的样本存放在液氮中保存），整个血样处理过程在生物安全柜中完成。

2.1.1.2　组织 组织样本在整个切取、转运、入库过程都在低温下进行，组织样本从热缺血到完成分装、入库的整个过程，时间控制在30min内。 组织离体后置于碎冰上进行转运，切取在低温操作台上进行，然后速冻在液氮中；样本整理入库过程在干冰上进行。 组织样本在手术切除后，剔除网膜、脂肪无用组织，用无菌、无RNA酶的生理盐水冲洗样本，去除样本上的黏液、血液。 为了避免交叉污染，使用消毒灭菌后的器材。 按照先正常组织后癌组织的顺序取材。 组织样本分装存储于RNAlater与液氮中；组织块的大小标准为液氮冻存的样本质量0.5-1.0ｇ、RNAlater冻存组织大小约5 ｍｍ× 5ｍｍ× 5ｍｍ。

2.1.2　存储条件控制  样本存储条件的稳定是样本质量的基本保障。 样本库配备了自动化温控监测系统对室温、低温冰箱、超低温冰箱、液氮罐进行24h持续监控，监测频率为30min 1次；如监测参数有异常，系统将自动报警并发送短信通知样本库工作人员，工作人员在 1h 内到达，现场处理并填写意外情况说明书。每天工作人员早晚 2次手工记录温度和液氮液位的变化情况于记录本上。

2.1.3   样本抽检   样本特别是肿瘤样本的异质性有时会导致肿瘤细胞过少，长期存储也会带来不可避免的降解，所以对样本进行抽检也是保证样本质量的重要手段。 样本的质量主要包括肿瘤组织样本的癌细胞比例、DNA／RNA 完整性、蛋白质完整性等。样本库参照行业公认的检测方法和标准，制定了自己的质量检测体系。根据病种类型、样本类型、储存方式等的不同，采用随机原则，每月随机抽取 ２％的样本，每年年初抽取0.1％的样本进行质量检测

2.1.3.1　DNA／RNA质量检测   主要检测DNA/RNA 的浓度、纯度及完整性。 用美国 Thermo 公司的 Kingfisher Flex 磁珠分选系统，全自动化提取样本中的 DNA/RNA ，然后用分光光度法检测DNA/RNA 的浓度和纯度，用琼脂糖凝胶电泳检测DNA/RNA 的完整性。 同时在这部分样本中，按照实验需要，聚合酶链反应检测特定基因（如癌胚抗原、3- 磷酸甘油醛脱氢酶）的完整性。

2.1.3.2　蛋白质质量检测  选择特定的抗体，用Western Blot 和酶联免疫吸附剂测定技术检测样本中蛋白的相应抗原，结合蛋白质谱分析来评估蛋白质的质量。

2.1.3.3　组织样本的质量检测  样本库主要采用苏木素和伊红染色方法评估组织中肿瘤细胞的百分比。 随机抽取样本，交由消化病理加工处理，按照国际肿瘤基因组协作研究肿瘤组织样本质量标准（肿瘤部分大于 80％质量良好、小于 65％为不合格样本），来进行衡量，记录到样本信息中。

2.2　信息的完整性 消化系疾病生物样本库的信息包含了样本库位信息、基本临床信息、随访信息、出入库使用情况及课题应用反馈数据。 样本库因为使用了专业的样本库管理软件，样本库位信息及出入库情况结合软件可轻松完成；主要工作在于完善基本临床信息和随访信息。 样本库的基本临床信息包括样本对应的患者各项生化检查、影像资料、病理信息及治疗情况；随访信息包括患者的疾病复发情况、生存状况、预后等。

详细的随访资料是保证样本“含金量”的重要条件，是样本转化、发挥价值的“催化剂”。 本样本库重视样本的信息建设，尤其是随访资料的完善和更新。 样本库有专门人员全职从事样本库对应患者的随访和数据库更新。 完善的患者疾病复发和存活情况相关随访信息极大地支撑了医院临床诊疗及科学研究的进行。 在临床通过随访获知的治疗结果为评估临床治疗方案提供了最终标准，有助于诊疗方案的完善和改进；在科学研究上为课题中总生存期及无病生存期的计算提供了数据，是课题具备临床意义的重要证据。

本样本库支持了大量的研究课题，提供的样本在使用后，要求使用者反馈样本数据，这些数据包括样本DNA/RNA 完整性、组织样本肿瘤细胞百分比基本质量信息，还包括该课题产生的特有实验数据。这些反馈信息有利于改进样本库的建设，同时也有利于被以后的研究者使用，避免了不必要的浪费，提高了样本的利用率。

对样本信息进行有计划的抽检。 每月按 10％的比例随机抽取新入库的样本，检查样本信息的完整性和准确性，主要检查新入库的样本临床和基础信息是否正确和完整、是否随访及随访信息是否输入样本库、条码是否有错贴和漏贴、虚拟库与实体库的位置是否一一对应、相关的记录是否完整。

3 可持续发展

生物样本库作为临床、基础和转化医学研究基石和重要推动力[11] ，只有得到充分的应用，才是一个充满活力的生物样本库，才是富有强劲生命力的可持续长久健康发展的生物样本库[12]。

在样本库的支持下，医院取得了一定的成绩。 初步建立了Immuo-Plex胃癌多标志物联合检测系统，运用该系统，验证了一系列新胃癌标志物候选分子，并从中筛选得到了6个变化明显的候选标志物，旨在开发我国第1个胃癌血清学多变量标志物诊断试剂盒；初步建立了微流控检测技术，该技术与传统方法相比，具有无创伤、特异性强、灵敏度高等优点；建立了系统的胃癌多药耐药组学数据库，在此基础上，进一步开发了新型耐药组学数据整合分析算法———Penetrating-Rank算法，能够高通量预测新的耐药关键分子。 同时，在样本库的保障下，发表了论文（影响因子≥5分）47 篇，其中临床相关文章34 篇；获批专利34项，国际专利6项，其中转让专利6项、总转让经费约1806万元；获得了2012年陕西省科学技术一等奖，取得了良好的科研效益和社会效益。

消化系疾病生物样本库建立了包括胃癌、结肠癌、胰腺癌、食管癌、间质瘤、肠病共6个组织分库，涵盖了重点研究的所有消化系疾病。 在样本库建设过程中始终把保证样本实体的质量、信息质量尤其是随访信息质量作为建设的基本要求，已建立规范的标准操作程序及严格的质量控制体系来规范样本库的整个建设过程。

西京消化病医院消化系疾病生物样本库无论在样本数量上还是质量上都有力地推进了医院临床研究、基础医学研究的发展；同时，临床研究及基础医学研究反过来又为样本库指明了建设方向，提出了要求，也提供了支持。 这种“以收集促研究，以研究促收集”的模式，是本样本库持续运行和发展的保证。

作者：窦建华，唐光波，李曾，姜孟孟，陈铮，胡思隽，赵青川，吴开春，聂勇战

作者单位：第四军医大学西京消化病医院