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“诗华诺倍威”推荐阅读【猪群保健】母猪流行性腹泻返饲后免疫应答评估

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摘  要:当前,猪流行性腹泻病毒(PEDV)流行广、危害严重。除进行疫苗免疫工作外,返饲常常做为猪场控制猪流行性腹泻的重要手段。笔者用6头育肥后期猪模拟母猪返饲(攻毒)实验,研究母猪返饲后排毒情况与血清抗体消长变化,来探究母猪返饲最佳时机以及如何避免返饲带来的风险。结果表明,试验猪在返饲后第2、3天相继发生腹泻并检测到PEDV,在返饲后11 d猪血清中IgG抗体明显上升,并在攻毒后第20天IgA与IgG检测值均达到峰值,在攻毒后第15天唾液与粪便均检测不到病毒。说明,生产上在产前15 d到30 d之间返饲效果较好,病毒感染仔猪的风险最低。为临床防控该病提供理论依据。

关键词:母猪;流行性腹泻;返饲


猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine  epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种严重的病毒性传染病。该病具有极高的感染性,可引起猪群发生严重的腹泻,特别是7日龄以内哺乳仔猪,致死率极高。本病虽多发生于寒冷季节,但在夏季也存在感染发病的情况。该病已经被加拿大、亚洲、及其他欧洲国家报道,2013在美国也报道过该疾病,并在一年的时间里对美国的养猪业造成高达9亿~18亿美元的经济损失。对于PED防治问题,仍然困扰着国内大多数猪场,现市场上对于防治PED的疫苗虽有很多,但是PEDV还是出现于免疫猪群中,说明疫苗免疫保护效果不佳。特别在2010年以后我国PED的发病趋势更加严重,不同阶段的猪群均出现严重的腹泻、呕吐与脱水,部分猪场初生仔猪的死亡率高达100%,对我国养猪业造成了巨大经济损失。

1    材料与方法

1.1  材料

1.1.1  主要诊断试剂

PEDV检测胶体金购自Bionovet公司;RNA提取试纸盒购自北京天恩泽基因科技有限公司;RNA反转录试纸盒购自美国Thermo Scientfic;PCR MIX购自北京擎科新业生物技术有限公司。引物由上海铂尚生物技术有限公司合成。

1.1.2  样品

收集攻毒后实验猪的腹泻粪便与唾液,以及攻毒前后攻毒猪血清。

1.2  方法

1.2.1  返饲及采样方案

1)返饲前病料处理:取PEDV阳性初生仔猪肠道以及内容物300 g,经病原检测无猪瘟、猪伪狂犬和蓝耳病病原后,加入300 mL含青链霉素各60万单位的生理盐水,用组织捣碎机匀浆,取1 mL匀浆后的病料于-80 ℃保存,配合荧光定量PCR 测定返饲病料中病毒的拷贝数,返饲病料及时保存于4 ℃,并在1 h内进行返饲。

2)返饲:猪舍提前3 d彻底消毒,并用大量清水将猪舍冲洗干净,为了促进猪发生腹泻,在生猪运输前不控料、运输到实验室后马上进行返饲,并且不进行控料和胃肠功能调理工作。用保定绳对猪上颚进行保定,并抬高猪的头部,每头猪缓慢灌服100 mL返饲病料,灌服时不断轻轻揉捏猪喉头,加快猪的吞咽动作避免浪费。

3)返饲后饲养管理:6头猪分为3栏饲喂(栏舍宽2 m,长2.5 m),攻毒期间打开猪舍内两个吊扇(美的牌屋顶式吊扇调至最高档),返饲期间气温为19~25 ℃,返饲后每天早上8点到夜晚10点,每隔3 h用冷水冲洗猪舍与猪臀部,返饲后第4天停止对猪与猪舍凉水冲洗,并关闭猪舍内的吊扇。腹泻期间让猪只自由采食,腹泻第2天在饲料中添加适量的红糖与食用盐,腹泻好转后每天分2次饲喂,并停止使用红糖与食用盐,攻毒后第6天给生猪饲喂含益生菌的饲料添加剂,调节胃肠道功能。

4)样本采集:腹泻期间每隔3 h收集一次腹泻粪便并做好标记,腹泻好转后每隔7 d收集一次粪便和肛门拭子,并用唾液收集条采集唾液,样本收集后全部保存于-80 ℃冰箱中。

1.2.2   病原检测

1)将攻毒后生猪第一次腹泻的粪便进行收集,并用韩国金诺生产的胶体金PEDV检测试剂盒按说明书进行检测;

2)将攻毒后第3天与第6天6头猪腹泻粪便,以及攻毒后第15天6头猪的唾液与肛门拭子。分别按照RNA提取试剂盒与RNA反转录试剂盒说明书,采用RT-PCR方法检测PEDV,同时对攻毒后第3天的腹泻样品用荧光定量PCR测定病毒的CT值与拷贝数。

1.2.3 血清抗体检测

    攻毒后每隔4~7 d对猪耳缘静脉采集一次血清,将采集的血清按本实验室建立的方法,进行PEDV IgG、IgA抗体检测。

2  结果

2.1  攻毒后第一次腹泻粪便PEDV胶体金检测结果

在攻毒后第2天有5头猪发生腹泻,第3天6头猪全部发生腹泻,取攻毒后第一头腹泻猪的粪便进行PEDV检测,结果在胶体金的质控带与检测带都出现了阳性条带,说明攻毒后第1头腹泻猪的粪便为PED阳性,部分检测结果见图1。

2.2  攻毒后第3天腹泻粪便PEDV RT-PCR检测结果

分别采取6头猪攻毒后第3天的排泄物,经RT-PCR (30循环)检测,各个样品在477 bp处均有一条特异性条带,说明6份样本PEDV检测均为阳性(图2),攻毒后第6天的腹泻粪便检测带信号稍弱一些,攻毒后第15天收集的唾液与粪便棉签PEDV全阴性。

由图1的结果可知,在第1头腹泻猪的粪便中可检测到PEDV,故在图2中没有设置阳性对照样品,攻毒后第3天猪腹泻粪便经RT-PCR检测中条带很亮,可以说明6头猪已全部感染PEDV并出现排毒;而攻毒后第15天的唾液与粪便棉签检测全阴,说明6头猪体内已无PEDV。

2.3 返饲病料与部分腹泻样品荧光定量PCR检测结果

利用荧光定量PCR检测技术,分别对返饲病料与攻毒后第3天6头猪的腹泻粪便进行检测,其病毒检测的CT值与拷贝数如表1所示。

2.4  血清抗体IgA、IgG检测结果

将攻毒前后6头猪所采集血清分别进行PED抗体检测,并求出血清中IgA与IgG平均 OD值,结果见表2、图3。由表2和图3可见在攻毒后11 d猪血清中IgG抗体明显上升,并在攻毒后第20天IgA与IgG检测值均达到峰值。 

3  分析与讨论

国外猪场在发生PED时,通常采用返饲技术控制了疫情,例如美国在2013年暴发PED,就是采取返饲措施及时控制了疾病,而国内猪场很少有成功利用返饲的案例,可能主要有2个方面原因的影响,一方面说明部分猪场在返饲的技术上缺乏正确的指导方案;另一方面暗示着部分猪场担忧返饲的安全性。

目前国内虽有上市的PEDV弱,但是效果仍在观察中,并且不能口服免疫,在这种情况下,返饲可作为一种选择。国外也有学者研究PEDV的攻毒实验,例如:在De Arriba ML PEDV接种试验中,仔猪的腹泻持续时间平均时间为1.7 d,持续排毒时间平均为5.4 d 。由于本试验为了模拟寒冷的天气,对攻毒猪采取了冲凉水与风扇降温,从而使本试验猪腹泻时间比De Arriba M L接种PEDV的试验猪要长,根据各个猪场饲养管理的不同,腹泻持续时间不等,一般在腹泻一周以内逐渐好转。临床上在促进猪群同期感染后,还需采取适当措施避免腹泻过度,例如对母猪返饲后,可通过加强隔离与消毒,改善环境温度与控制饲喂量,以及在饲料中添加一些微生态制剂,可以缩短母猪腹泻与排毒时间,并且同样能达到返饲效果。

由于试验动物是育肥后期猪,每次冲水就有猪站立排粪,能清楚的记录腹泻时间与对应猪编号,使数据更加准确。虽然本试验不能确定母猪攻毒后第几天停止排毒,但是可以明确母猪在攻毒后临床表现腹泻症状时,就开始向外界排毒,并且在攻毒后15 d的唾液与粪便中无PEDV。然而临床上攻毒15 d后,对攻毒猪仍然不能掉以轻心,在4 ℃ pH=5~9的条件下,PEDV可在污染的泥土中至少存活28 d,由表1可知,返饲后第3天腹泻粪便中病毒的拷贝数与返饲病料相当,说明猪舍环境中可能有大量病毒粒子的存在,为了防止PEDV在猪场的传播,母猪在攻毒后需对猪只体表与猪舍加强消毒,及时处理腹泻粪便,可以降低病毒感染其他猪群的风险。

由图3可知:母猪在攻毒后抗体在11~30 d,血清中IgA与IgG的抗体滴度维持在较高的水平,结合试验猪攻毒后第15天排泄物病原检测结果。对于母猪的返饲工作,可在其妊娠期的84到99 d之间进行返饲,尤其是对于一些正在发生PED的猪场,可对所有处于产前15 ~30 d的妊娠母猪进行返饲,能够及时地减少损失。这一观点也与Olanratmanee E得出的结果相符合,用7 201头母猪在产前不同时期进行返饲,其中返饲对妊娠61~90 d母猪的流产率最低。

刘秋菊用16头60日龄左右的仔猪做攻毒试验中,仔猪IgG抗体在攻毒后第16天达到最高,其检测OD均值为1.0左右。根据图3所示,在攻毒后第42天母猪的血清IgG抗体OD均值为0.98,尽管在PEDV防治措施中,主要靠肠道的黏膜免疫(IgA抗体),但初乳中若含有较高滴度的IgG抗体,对仔猪同样具有保护作用,由此推出:母猪在返饲后的第11~42天,初乳中的抗体对哺乳仔猪有一定的保护作用,为了延长返饲后抗体保护时间,可在返饲后30~42 d进行组织灭活苗的加强免疫。

在过去的十年里,泰国也推荐利用返饲来扑灭商业猪群暴发的PED。返饲是一把双刃刀,并不是所有场都适合返饲,必需在配合实验室检测的条件下,确定返饲病料中无猪瘟、伪狂犬与猪蓝耳病病原,才可利用返饲控制PED在本场的流行。


注:本文选自《猪业科学》2017年第5期“猪群保健”栏目:P102-104(版权归《猪业科学》所有,如转载,请注明出处)。

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