基于中药传统用法的毒性Q-Marker发现:以吴茱萸为例

中药的毒性有狭义和广义之分，《内经》认为“药即为毒”，中药之毒即其效，提出了毒的广义概念；而近现代的毒一般指其毒副作用和毒性反应，是毒的狭义概念^[1]。在临床实践中，因为与药物的安全性和有效性直接相关，中药的毒性一直备受关注，加上近年来中药中毒事件时有发生^[2-4]，严重影响了中医的声誉和中医药事业的发展，因此，有必要对有毒中药的毒性物质基础、作用机制、安全限度和质量控制等进行深入研究，建立健全有毒中药的合理评价体系。结合刘昌孝院士提出的中药质量标志物（Q-Marker）的新概念^[5-6]，本课题组提出了基于“谱-毒”相关的毒性Q-Marker合理辨识与科学控制的研究思路^[1]，并以吴茱萸为例进行了初步研究。

吴茱萸为芸香科植物吴茱萸Euodia rutaecarpa (Juss.) Benth.、石虎Euodia rutaecarpa(Juss.) Benth. var. officinalis(Dode) Huang或疏毛吴茱萸Euodia rutaecarpa (Juss.) Benth.var. bodinieri (Dode) Huang的干燥近成熟果实，归肝、脾、胃、肾经，具有散寒止痛、降逆止呕、助阳止泻的功效^[7]。吴茱萸始载于《神农本草经》，列为中品，为温中止痛的必备药，其味辛、苦，性热，有小毒。近年来，随着吴茱萸临床应用的拓展，服用生吴茱萸、炮制不透的吴茱萸和过量服用导致中毒的报道越来越多，引起了业界的广泛关注^[8]。近年来，国内外学者对吴茱萸的毒性进行了较为深入的研究，发现吴茱萸水提物、醇提物、挥发油、生物碱等不同部位或成分群均具有一定的毒性，其毒性表现以肝损伤为主，并具有一定的“量-时-毒”关系^[9-13]，其肝毒性机制可能与氧化应激和炎症反应有关^[14-15]。

吴茱萸临床应用主要有水煎煮、全粉入药、外敷3种用法，如吴茱萸汤为水煎煮，左金丸为全粉入药。在对吴茱萸方剂的文献研究中发现，吴茱萸在汤剂使用时，多数中医文献提到吴茱萸临用前需要“汤洗”且“煎煮”时间较长，如东汉张仲景所著《伤寒论》记载：“吴茱萸汤。方二十九。吴茱萸，一升，洗。……，右四味，以水七升，煮取二升”，后世也多沿用了“久煎”和“汤洗”的用法。吴茱萸自《神农本草经》后出现了炮制的记载，其目的均为去小毒、去苦味、去涎等^[16]，由于吴茱萸自古以来均被认为有“毒”，故推测吴茱萸“久煎”“汤洗”的传统用法与其毒性相关。因此，本研究以吴茱萸“久煎”“汤洗”的传统用法文献研究为切入点，运用指纹图谱、质谱分析和体外肝毒性评价技术，采用灰色关联分析法进行“谱-毒”相关分析，初步锁定肝毒物质基础，建立中药毒性Q-Marker合理辨识技术，并以吴茱萸为例，解析中药传统用法的科学内涵。

1  材料

1.1  试剂与药材

绿原酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号110753-200413），噻唑蓝（MTT，Sigma公司，批号20160512）；丙氨酸转氨酶（ALT）测试盒（批号20161016，货号C009-2）、天冬氨酸转氨酶（AST）测试盒（批号20161004，货号C010-2）、乳酸脱氢酶（LDH）测试盒（批号20160928，货号A020-2），均为微板法，购于南京建成生物工程研究所；乙腈（色谱纯，德国Fisher公司），水为超纯水，甲酸、甲醇等其他试剂均为分析纯。吴茱萸样品共12份，经山东省中医药研究院林慧彬研究员鉴定为芸香科植物吴茱萸Euodia rutaecarpa (Juss.) Benth.、石虎Euodia rutaecarpa (Juss.) Benth. var. officinalis (Dode) Huang或疏毛吴茱萸Euodia rutaecarpa (Juss.) Benth. var. bodinieri (Dode) Huang的干燥近成熟果实，见表1。

1.2  仪器

1200系列高效液相色谱系统，ChemStation工作站，二极管阵列检测器，自动进样器（美国安捷伦公司）；6320离子阱质谱检测器（美国安捷伦公司）；BP211D型电子天平（德国赛多利斯集团）；LC-350A超声波中药处理机（济宁市中区鲁超仪器厂）；KDM型控温电热套（鄄城华鲁电热仪器有限公司）；BB-16型二氧化碳培养箱（德国贺利氏集团）；XSZ-D倒置显微镜（日本奥林巴斯公司）；Multiskan Go型酶标仪（芬兰雷勃公司）；超低温冰箱（中国海尔集团）；96孔培养板（美国康宁公司）；台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；Simplicity纯水仪（美国密理博公司）。

1.3  细胞系

人正常肝细胞L02细胞系，购自中国科学院上海细胞生物学研究所，在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，于37 ℃、5% CO₂进行常规培养，实验均在细胞生长对数期进行。

2  方法与结果

2.1  吴茱萸HPLC指纹图谱的建立

2.1.1  对照品溶液的制备  取绿原酸对照品适量，精密称定，加甲醇配制成1 mg/mL的对照品溶液。

2.1.2  供试品溶液制备  取吴茱萸供试品粉末（过3号筛）0.5 g，精密称定，加入25 mL水，称质量，回流提取60 min，冷却至室温，用水补足减失的质量，摇匀，滤过，滤液过0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.1.3  色谱条件  色谱柱ThermoSyncronis C₁₈（250 mm×4.6mm，5 μm）；流动相0.3%磷酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脱：0～25 min，4%～6.5% B；25～32 min，6.5% B；32～37 min，6.5%～8% B；37～56 min，8% B；56～75 min，8%～17% B；75～90 min，17%～20% B；90～120 min，20%～50% B；120～135 min，50% B；柱温30 ℃；体积流量1.0 mL/min；检测波长220 nm。色谱图见图1。

2.1.4  方法学考察  取同1份（编号S1）吴茱萸样品，进行精密度试验、重复性试验、稳定性试验，以图1中色谱峰14为参照峰，各主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积RSD值均小于3%，表明仪器精密度和方法重复性良好，供试品溶液在24 h内稳定。

2.1.5  相似度评价  将按照“2.1.3”项中方法所得12批吴茱萸指纹图谱数据依次导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”软件。以S1号样品色谱图作为参照图谱，经过多点校正、自动匹配，以中位数法生成对照图谱，标定了34个指纹峰，指纹图谱叠加图见图2，计算相似度，各样品指纹图谱相似度为0.869～0.997，结果见表2。

2.1.6  指纹图谱数据分析  将获得的指纹图谱12×34数据矩阵导入SIMCA-P 14.1进行偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA）^[17]。首先提取主成分，前3个主成分累积贡献率R²_Y（cum）达到92.5%，可以解释原变量92.5%的信息，超过了主成分分析一般要求的85%，表示模型概括解释率的参数R²_X（cum）＝0.689，表明模型预测能力的参数Q²（cum）＝0.724，一般认为R²和Q²值大于0.5时，模型的稳定性及预测能力均较好，可以进行分析，以前3个主成分绘制3D散点图，见图3，进行层序聚类分析（HCA），树状图见图4。从图3和图4可以看到样品分为3类，样品S1～S5、S6～S9、S10～S12分别聚为1类，分别对应石虎、疏毛吴茱萸和吴茱萸，分类与基原符合，说明建立的指纹图谱可以反映不同吴茱萸样品的化学成分区别。

2.2  不同煎煮时间的吴茱萸水煎液对L02细胞的影响

2.2.1  供试品溶液制备  取S1吴茱萸供试品粉末（过3号筛）0.5g，精密称定，加入25 mL水，称质量，回流提取，提取时间为10～120 min，间隔10min，冷却至室温，用水补足减失的质量，摇匀，滤过，即得。

2.2.2  细胞生长曲线的测定  将L02细胞以1.2×10⁴/mL接种在48孔细胞板上于37 ℃、5% CO₂培养，24 h后除对照组其余各孔均加入不同煎煮时间的吴茱萸样品培养24 h，每隔4 h用酶标仪测定培养液490 nm处吸光度（A）值。每组设置3个复孔，连续观察48 h，绘制细胞生长曲线。

不同煎煮时间的吴茱萸样品作用后L02细胞的生长曲线见图5，结果表明在接种L02细胞16 h之后细胞呈现对数增长，在24 h时达到峰值，一般选择在L02细胞的对数生长期进行药物干预，因此24 h为最佳给药时间。

在给予不同煎煮时间的吴茱萸样品干预后，相较于对照组，药物组细胞整体呈现生长抑制状态；药物各组间对比显示，随着煎煮时间的延长，药物对细胞的抑制作用增强，在60 min时吴茱萸药物组对细胞的抑制作用最强，随后延长煎煮时间，抑制作用相较于60 min组减轻。提示在60 min前吴茱萸随煎煮时间的延长毒性作用增加，呈现时间-毒性作用正相关，在60 min之后随煎煮时间的延长毒性作用出现不同程度的减弱，但此时不具有时间-毒性作用负相关性，说明延长煎煮时间具有降低吴茱萸毒性的作用。

2.2.3  不同煎煮时间的吴茱萸样品对L02细胞抑制的影响  将培养48 h后的L02细胞取出，吸弃培养基，每孔加入0.5 mg/mL的MTT溶液200 μL，置培养箱中继续培养4 h后，吸去培养基，每孔加入DMSO 100 μL，震荡混匀，用酶标仪检测570 nm波长下的A值。计算增殖抑制率（IR，IR＝1－药物组A值/对照组A值）。不同煎煮时间的吴茱萸样品对L02细胞的IR变化曲线见图6。

结果表明在给予不同煎煮时间的吴茱萸样品后，L02细胞呈现不同程度的增殖抑制，煎煮时间60 min前，水煎液对L02细胞的IR随煎煮时间的延长而增加，在60 min时达到峰值，60 min后IR迅速下降并保持减弱趋势，提示延长煎煮时间具有降低吴茱萸对人正常肝细胞增殖抑制的作用。

2.2.4  不同煎煮时间的吴茱萸样品对L02细胞上清液LDH、ALT、AST的影响 取上述培养的细胞上清液10 μL，根据LDH、ALT、AST试剂盒说明书进行操作，检测不同煎煮时间的吴茱萸样品对L02细胞上清液LDH、ALT和AST的影响，结果见表3。

从表3可见，吴茱萸煎煮时间为60min时，对L02细胞的影响达到最大，与对照组相比较，LDH、ALT和AST均有显著差异（P＜0.001）。煎煮时间在10～60 min时，随煎煮时间的延长，L02细胞上清液LDH、ALT和AST的变化增强；吴茱萸煎煮时间为60min时，对L02细胞的影响达到最大，与对照组相比较，此时LDH、ALT和AST的增长幅度最高，分别为61.26%、61.44%和58.72%。在60 min之后程度减轻，到120 min时，与60 min比较，各指标分别下降55.35%、52.91%和50.78%。以上数据说明吴茱萸煎煮一段时间后肝毒性会达到峰值，延长煎煮时间可不同程度地降低吴茱萸对L02细胞的毒性作用。

2.3  谱毒相关分析

采用Matlab（R2012a）软件，利用灰色关联分析法进行谱毒相关分析。以指纹图谱共有峰面积为子序列，不同煎煮时间的吴茱萸样品对L02细胞上清液LDH、ALT、AST的指标值为母序列，对数据进行无量纲化处理，分别计算灰色关联度，根据关联度大小确定各色谱峰对各指标的贡献度大小，灰色关联分析结果见表4。

从表4中数据可见，对于L02细胞的LDH、AST、ALT毒性指标，成分2、5、8均高度相关，关联度均＞0.7，呈现了很高的一致性，提示成分2、5、8可能是吴茱萸水煎液的毒性成分。在指纹图谱中，2、5、8号峰在乙腈为4%～6.5%即可洗脱，保留时间短，说明3者均为大极性成分，因此，吴茱萸水煎液中的大极性成分可能为肝损伤成分，从现代研究的角度证明了吴茱萸“汤洗”的传统用法可降低吴茱萸的肝毒性。

2.4  质谱分析

2.4.1  质谱条件  采用“2.1.3”中的色谱条件，将流动相磷酸水溶液换为同浓度的甲酸水溶液进行质谱检测。采用电喷雾离子源；正负离子交替扫描模式；扫描级数5级；扫描范围m/z 50～1 000；扫描速度m/z26 000/s；喷雾气压力241.325 kPa（35 psi）；干燥气温度350℃；干燥气流速9 L/min；毛细管电压4000 V，分流比4∶1。总离子流图见图7。

2.4.2  质谱解析  质谱TIC图进行高斯平滑处理，对2、5、8色谱峰积分，分别抽取色谱峰平均质谱图，扣除背景噪音，记录MSⁿ各级质谱TIC图主要离子碎片平均丰度，同时记录各峰全扫描紫外光谱的吸收峰，结果见表5。

通过与绿原酸紫外光谱对比发现，峰2、5、8的紫外吸收光谱与绿原酸完全一致，说明2、5、8分子中的生色团和母核结构应与绿原酸基本相同，均为桂皮酰共轭体系^[18]。

对峰2、5、8的正离子模式多级质谱进行解析发现，其正离子模式的裂解方式基本一致，且各级质谱的离子碎片丰度差异不大，应为结构相似的同分异构体。一级质谱均包含[M＋H]⁺和[M－H₂O＋H]⁺，[M－H₂O＋H]⁺均为基峰；二级质谱中质荷比m/z 163的离子碎片与绿原酸二级质谱中m/z163的离子碎片裂解方式和碎片离子峰丰度基本一致，绿原酸二级质谱中的m/z 163离子碎片为绿原酸中酯键发生异裂，咖啡酸一侧碳氧键断裂，丢失1分子奎宁酸后生成的 [咖啡酸-H₂O＋H]⁺特征碎片，因此推断峰2、5、8的结构中包含1分子咖啡酸。

对峰2、5、8的负离子模式多级质谱进行解析发现，一级质谱中基峰均为溶剂加合离子，二级质谱基峰为准分子离子峰[M－H]⁻，三级质谱为母离子发生异裂，咖啡酸一侧的碳氧键断裂，丢失1分子咖啡酸后的特征碎片，质荷比为m/z195。参考绿原酸的裂解方式，绿原酸丢失1分子咖啡酸后产生奎宁酸的特征碎片 [奎宁酸－H]⁻，质荷比为191，推断峰2、5、8的分子结构中与咖啡酸缩合的部分比奎宁酸相对分子质量大4，应为结构与奎宁酸类似，相对分子质量为196的有机酸，分子式经计算为C₆H₁₂O₇，推断为葡萄糖酸。

最终推断峰2、5、8均为咖啡酸与葡萄糖酸缩合产生的咖啡酰缩酚酸，由于葡萄糖酸结构中存在4个手性碳，因此，2、5、8应为手性不同导致的同分异构体。具体的缩合位点和分子结构还需进一步研究。

3  讨论

本实验供试品制备采用水回流提取，预试验采用单因素法考察了煎煮时间和液固比，分别60 min和50∶1时提取效果较好。色谱柱考察了Thermo Syncronis C₁₈、Scienhome Kromasil C₁₈、Agilent Zorbax SB-C₁₈、Agilent Eclipse XDB-C₁₈，流动相考察了磷酸水、甲酸水和乙酸水，结果发现色谱柱采用Thermo Syncronis C₁₈，流动相采用乙腈-磷酸水体系分离度较好。对色谱图采集波长进行了考察，进行全波长扫描发现210 nm时色谱信息最丰富，但是因为接近流动相的截止波长，基线难以平衡且噪音大、稳定性差，检测波长大于240 nm时会发生较多色谱信息丢失，故选择色谱信息较丰富、稳定性和信噪比较高的220 nm作为检测波长。

前期研究证实，吴茱萸有肝脏毒性^[13,19-20]，L02细胞为人肝细胞，适宜于肝毒性的发现和评价，且与临床体内毒副作用相关性强，故选择L02细胞作为毒性评价模型。通过不同时间点吴茱萸水煎液的肝毒性研究发现，煎煮时间为60 min时，水煎液的肝毒性达到最大值，其后迅速降低，在之后的60 min内保持较平缓的降低趋势，这个结果证明吴茱萸“久煎”可以降低肝毒性，为历代文献记载的吴茱萸汤需“久煎”提供了现代毒理学证据。

自《伤寒论》记载吴茱萸汤“汤洗”之后，后世含吴茱萸的方剂其用法中细分为“汤洗”“汤淘”“汤浸”“汤泡”等，关于时间的记载有“七次”“三遍”“一宿”等，并没有详细的温度记载^[21]。但初步提示“汤洗”的用法旨在减少大极性成分，此为古人最朴素的减毒方法；本研究采用灰色关联分析方法对吴茱萸水煎液化学成分的表征和体外肝毒性结果进行“谱-毒”相关分析，发现大极性成分是吴茱萸的肝毒物质基础之一，可作为肝毒性质量控制的Q-Marker；从现代研究的角度证明了吴茱萸“汤洗”的传统用法可降低吴茱萸的肝毒性。

本研究从历代方剂文献的用法信息挖掘入手，通过对吴茱萸“方剂构成-功效主治-传统用法”的分析，选择古人旨在“减毒”的“久煎”“汤洗”的传统用法为研究切入点，提出基于中药传统用法的中药毒性Q-Marker的辨识思路，运用指纹图谱、液质联用、毒理学技术和“谱-毒”相关分析方法，锁定其肝毒物质基础，一方面对吴茱萸的传统用法进行了科学解析，有利于保证临床安全可控用药；另一方面，该肝毒物质基础可作为吴茱萸的毒性Q-Marker，为其安全质控奠定基础；后续将进一步对其进行直接验证，达到基于“效-毒”相关的含量范围和安全限度，在“药材、饮片、提取物、中成药”全产业链中可控的动态“标识”过程。

参考文献（略）

 此文摘自：王  亮，窦立雯，郭  威，李晓宇，杨  倩，吴晓文，孙  蓉. 基于中药传统用法的毒性Q-Marker发现：以吴茱萸为例 [J]. 中草药, 2017, 48(6): 1159-1166.