玫瑰花挥发油对小鼠急性心肌缺血损伤的保护作用研究

玫瑰花为蔷薇科（Rosaceae）蔷薇属Rosa L. 多年生灌木玫瑰Rosa rugose Thunb. 的干燥花蕾，性温、味甘，具有行气解郁、疏肝理气、和血散瘀等多种功效^[1-2]。玫瑰花中富含挥发油类物质^[3]，而挥发油具有较强的自由基清除活性^[4]。为了探讨玫瑰花挥发油对小鼠急性心肌缺血的保护作用，本实验采用ip异丙肾上腺素的方法复制小鼠急性心肌缺血损伤模型^[5]，观察玫瑰花挥发油对急性心肌缺血小鼠心肌组织形态、抗氧化能力等相关指标的影响，为玫瑰花挥发油药理作用及机制的探究和临床应用提供一定的理论依据。

1  材料

1.1  实验动物

清洁级昆明种雄性小鼠90只，体质量18～22 g，购于新疆实验动物研究中心，许可证号SCXK（新）-2011-0001。

1.2  药品与试剂

玫瑰花挥发油（单方精油，批号20140122，购于新疆和田阳光沙漠玫瑰有限公司）；盐酸普萘洛尔片（江苏亚邦爱普森药业有限公司，规格10 mg/片，批号1508161）；2,3,5-三苯基氯化四氮唑（北京索莱宝科技有限公司，规格1 g/5 g，货号T8170）；盐酸异丙肾上腺素注射液（上海禾丰制药有限公司，规格1 mg/2 mL，批号41150402）；聚山梨酯-80、甘油（北京索莱宝科技有限公司）；甲醛（成都市科龙化工试剂厂）；生理盐水（国药集团新疆制药有限公司）；乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3  仪器与设备

Agilent 6890N气相色谱Agilent 5973N质谱联用仪（美国安捷伦科技有限公司）；BL-420F生物机能实验系统（成都泰盟科技有限公司）；UV-2401紫外分光光度计（日本岛津公司）；Thermo 3001型多功能酶标仪（美国Thermo公司）；TDL-50B低速大容量离心机（上海安亭科学仪器厂）； BCD-268DA冰箱（青岛海尔股份有限公司）；DHP-9162电热恒温培养箱（上海齐欣科学仪器有限公司）。

2  方法

2.1  玫瑰花挥发油化学成分分析 

2.1.1  色谱条件  HP-5色谱柱（30.0m×320 μm，0.25μm）；采用程序升温：50 ℃维持5min，以2 ℃/min，上升至250 ℃（5 min）；进样口温度250 ℃，检测器温度280 ℃，载气为氮气，体积流量为1 mL/min，进样量为1 μL，分流比为10∶1。

2.1.2  质谱条件 EI离子源，正离子模式，电子能量7eV，离子源温度200 ℃，接口温度250 ℃，扫描质量m/z20～500。

2.2  玫瑰花挥发油对急性心肌缺血小鼠的影响

2.2.1  实验分组及给药  心电图正常的健康昆明种小鼠90只，随机分为6组：对照组，模型组，玫瑰花挥发油高、中、低剂量（160、80、40 mg/kg）组，盐酸普萘洛尔（48 mg/kg）组，每组各15只。对照组和模型组ig给予等体积的生理盐水，给药组ig相应剂量的药物，体积为10 mL/kg，每天早晚各给药1次，连续给药15 d。

2.2.2  小鼠急性心肌缺血模型的制备  各组给药第13天，早上给药30 min后，除对照组外，其余各组小鼠均ip盐酸异丙肾上腺素（10 mg/kg），每天1次，连续3 d。第15天ip盐酸异丙肾上腺素30 min后，ip 3.5%水合氯醛麻醉，对小鼠进行心电图监测。造模成功标志为与对照组比较，II导联心电图T波倒置或异常增大、ST段异常升高或降低。

2.2.3 心肌组织病理形态学观察  小鼠眼球取血后，处死，取出心脏，冰的生理盐水清洗污血，4%甲醛溶液固定。用HE染色法观察心肌组织病理学变化，根据水样变性、脂肪变性、血管瘀血以及心肌纤维断裂程度等指标来评价心肌组织的病理形态学变化。

2.2.4  心肌缺血面积测定  小鼠眼球取血后，处死，取出心脏，用磷酸缓冲液PBS冲洗并冻存于−20 ℃的冰箱中，30min后取出心脏，快速以垂直心脏长轴的角度，均匀切成5片，切片置于TTC溶液中，37 ℃水浴孵育20 min后，用4%甲醛溶液固定12 h，拍照。切片中被染成红色的区域为正常组织，白色区域为缺血组织，使用Image-Pro Plus 6.0软件分析，计算心肌缺血面积（心肌缺血区面积占整个心脏面积的比例）。

2.2.5  心肌组织中SOD和GSH-Px活性的测定  小鼠眼球取血后，处死，取出心脏，切取心室部位，匀浆，3 500 r/min离心10min，取上层澄清液于EP管内，保存于−80℃的冰箱中，融化后，严格按照试剂盒说明书测定心肌组织中SOD和GSH-Px的活性。

2.2.6  血清中CK-MB和LDH水平的测定  小鼠眼球取血后，室温放置1～2 h，2 000 r/min离心10 min，取上层血清于EP管内，保存于−80 ℃的冰箱中，融化后，严格按照试剂盒说明书测定血清中CK-MB和LDH的水平。

2.3  统计学处理 

采用SPSS 19.0软件对相关实验数据进行统计学分析，实验结果以表示，采用单因素方差分析比较组间均值差异。

3  结果与分析

3.1  玫瑰花挥发油的化学成分分析

对玫瑰花挥发油的化学成分进行了GC-MS分析，共鉴定出50多种组分，总离子流图见图1，其中主要的化学成分为β-香茅醇（40.61%）、9-十九烯（7.26%）、香叶醇（5.45%）、乙酸香叶酯（1.61%）等。

3.2  对急性心肌缺血小鼠各项指标的影响

3.2.1  各组小鼠心肌组织病理变化  各组小鼠心肌组织病理变化结果见图2及表1。可以看出，对照组小鼠心肌组织结构完整，心肌细胞排列整齐、致密，胞浆染色均匀；模型组小鼠心肌纤维排列紊乱，出现广泛性水肿、淤血以及炎症细胞浸润，散在脂肪变性；玫瑰花挥发油160 mg/kg组小鼠心肌组织有轻微的水样变性、淤血，以及心肌组织点状坏死；玫瑰花挥发油80 mg/kg组小鼠的心肌排列整齐，出现少量的水样变性及脂肪变性；玫瑰花挥发油40 mg/kg组小鼠出现心肌组织轻度炎性细胞浸润、水样变性、脂肪变性、肌纤维断裂；盐酸普萘洛尔（48 mg/kg）组小鼠心肌纤维排列整齐，出现少量的炎性细胞浸润。

3.2.2  对急性心肌缺血小鼠心肌缺血区域面积的影响 玫瑰花挥发油对心肌组织局部心肌缺血区域面积的影响，见图3和表2。由图3可见，与对照组比较，模型组小鼠的心肌缺血区面积明显较多；与模型组比较，玫瑰花挥发油160 mg/kg组和玫瑰花挥发油组80 mg/kg组小鼠心肌的缺血区面积有一定程度的减少。由表2看出，模型组小鼠缺血区面积显著高于对照组（P＜0.001）；玫瑰花挥发油160 mg/kg组和40 mg/kg组小鼠缺血区面积显著低于模型组（P＜0.05）；玫瑰花挥发油80 mg/kg组小鼠缺血区面积显著低于模型组（P＜0.01），盐酸普萘洛尔（48 mg/kg）组小鼠缺血区面积与模型组比较，降低程度非常显著（P＜0.01）。表明玫瑰花挥发油可以减少急性心肌缺血小鼠心肌缺血区面积，对异丙肾上腺素所致的心肌缺血损伤有一定的保护作用。

3.2.3  对急性心肌缺血小鼠心肌组织中SOD和GSH-Px活性的影响  玫瑰花挥发油对急性心肌缺血小鼠心肌组织中SOD和GSH-Px的影响结果见表3。ip过量的异丙肾上腺素可以抑制机体SOD和GSH-Px的产生，进而导致机体内氧自由基和脂质自由基的增多，造成小鼠心肌缺血性损伤。与模型组比较，玫瑰花挥发油160、80mg/kg组和盐酸普萘洛尔组小鼠心肌组织中SOD和GSH-Px活性明显升高（P＜0.05、0.01），实验结果表明玫瑰花挥发油可以增加SOD和GSH-Px的产生，从而增加清除氧自由基和脂质自由基的作用，起到保护心肌的作用。

3.2.4  对急性心肌缺血小鼠血清中CK-MB和LDH水平的影响  玫瑰花挥发油对急性心肌缺血小鼠血清中CK-MB和LDH水平的影响结果见表4。通过测定小鼠血清中LDH和CK-MB的释放量，可检测各实验组小鼠的心肌损伤程度。从表4可以看出，模型组小鼠血清中CK-MB和LDH的水平均显著增加，与对照组比较差异显著（P＜0.01）。与模型组比较，玫瑰花挥发油160、80 mg/kg组和盐酸普萘洛尔组小鼠血清中CK-MB和LDH的量均显著降低（P＜0.05、0.01）。结果表明玫瑰花挥发油可以显著降低异丙肾上腺素所致的急性心肌缺血小鼠血清中CK-MB、LDH的量。

4  讨论

心肌急性缺血时，心肌对氧的供需失调，代谢出现紊乱，导致心肌细胞内多种酶如CK等释放入血，大量自由基聚集，引起脂质过氧化，进而加重缺血对心肌的损伤^[6]。而挥发油具有较强的清除自由基的能力，因此其对心血管等疾病的防治有重要意义^[4]。HE染色是检查组织发生病理变化的常用方法之一^[7]。本实验用HE染色法检测玫瑰花挥发油对异丙肾上腺素所致的小鼠急性心肌缺血的保护作用，结果发现，玫瑰花挥发油组可明显减少心肌纤维断裂，减少组织的水样变性和炎症细胞的浸润。TTC染色是检测心肌缺血程度最为直接的方法^[8]，结果发现玫瑰花挥发油组不同程度的减小了小鼠心肌缺血区面积，与模型组比较差异显著。SOD的主要功能是催化超氧阴离子的歧化反应，SOD量和活力的减少和降低，将导致自由基的堆积^[9-10]。心肌缺血时，细胞内Ca²⁺超载，自由基生成过多，清除能力下降，从而造成心肌的损伤。GSP-Px也是一种主要的抗氧化剂和自由基清除剂^[11]。实验结果显示，模型组小鼠体内SOD和GSP-Px的量明显降低，而玫瑰花挥发油组小鼠体内SOD和GSP-Px的量均有一定程度的增加，说明玫瑰花挥发油可以促进SOD和GSP-Px的产生，加快自由基的清除，从而起到保护心肌的作用。CK-MB存在于心肌细胞的胞浆或线粒体中，当心肌受损时，CK-MB释放入血，因此血清酶的升高可作为心肌受损的酶学标志物^[12]。LDH是体内能量代谢过程中的一个重要的酶，当心肌缺血时，LDH会释放入血，通过检测血清中LDH的量，可反映心肌细胞的损伤程度^[13-14]。实验结果显示，模型组小鼠血清中CK-MB和LDH的量明显升高，心肌损伤严重，玫瑰花挥发油组不同程度地降低了CK-MB和LDH的水平，说明玫瑰花挥发油对缺血损伤心肌有一定的保护作用。清除自由基和抗氧化作用可能是玫瑰花挥发油发挥心肌缺血保护作用的主要机制之一。

综上所述，玫瑰花挥发油对异丙肾上腺素诱导的急性心肌缺血具有一定的保护作用，有可能成为一种良好的抗心肌缺血新药的主要来源。

参考文献（略） 

来  源：宋旺弟，袁长胜，崔婷婷，申  静，陈  文. 玫瑰花挥发油对小鼠急性心肌缺血损伤的保护作用研究 [J]. 中草药, 2017, 48(22):4701-4706.