护骨胶囊含药血清对成骨细胞功能的影响
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文章来源：《中华中医药杂志》2017年第12期
作者：陈珺1，林思慧1，钟佳贤1,2，林泽苗1,2，曹祺2，曹克广2，龙世松2，李青南1
注：
1.广东药科大学生命科学与生物制药学院，广州 510006
2.广东安诺药业股份有限公司，广东揭阳 515300
☆转载需注明来源与作者
护骨胶囊由淫羊藿、制何首乌、巴戟天、骨碎补、龟甲、山药、熟地黄、当归、杜仲、续断10味中药组成，具有补肾益精、活血止痛、强筋壮骨的作用，临床治疗原发性骨质疏松症疗效显著，临床前动物/细胞实验亦证实护骨胶囊可促进成骨细胞的增殖分化、改善骨代谢状况，但其对成骨细胞成骨功能的具体调控及药效机制尚未完全明确。
本研究采用血清药理学方法制备护骨胶囊含药血清，观察其对大鼠原代成骨细胞增殖、分化的影响，并分析其调控骨形成过程中各成骨功能指标基因和上皮细胞钠离子通道（epithelial sodium channel，ENaC）基因表达水平的变化情况，结合课题组前期研究成果，探讨ENaC介导的骨代谢途径在护骨胶囊调节成骨细胞功能中的可能作用，为明确护骨胶囊的药效机制提供实验基础和理论依据。
一
材料与方法
1
动物
SPF级健康雌性SD大鼠12只，13周龄，体质量（300±20）g，购自广东省医学实验动物中心，动物质量合格证号：44007200017783；出生24h内SD大鼠（SPF级）乳鼠数只，购自广州中医药大学实验动物中心，动物质量合格证号：44005800003074
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药物与主要试剂
护骨胶囊（广东安诺药业股份有限公司，0.45g/粒，批号：20150101）；DMEM高糖培养基（Gibco，批号：8115324），0.25%胰酶-EDTA（Gibco，批号：1665739），Ⅰ型胶原酶（Sigma，批号：SLBS0997V），PBS缓冲液（Gibco，批号：8115207），Trizol（Thermo Fisher Scientific，批号：99001）；β-甘油磷酸钠（Sigma，批号：BCBN3185V），L-维生素C（Sigma，批号：SLBJ3270V），地塞米松（Sigma，批号：BCBN24500）；兔抗大鼠Alkaline Phosphatase（ALP）单克隆抗体（GeneTex，批号：61128），兔抗大鼠Osteopontin（OPN）多克隆抗体（GeneTex，批号：5692），小鼠抗大鼠Collagen-Ⅰalpha（Coll-Ⅰα）单克隆抗体（abcam，批号：GR185584-2），兔抗大鼠α-ENaC多克隆抗体（Santa Cruz，批号：SC-21012）；CCK-8试剂盒（Dojindo Laboratories，批号：FQ602），碱性磷酸酶测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20150922），偶氮偶联法碱性磷酸酶染色试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20151223），PrimeScriptTM RT-PCR Kit两步法试剂盒（Takara，批号：AK3101），BCA蛋白定量试剂盒（康为世纪，批号：CW0014）。
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主要仪器
Microplate Reader 680酶标仪（Bio-Rad）；Mycycler梯度PCR仪（Bio-Rad）；Tanon 4100凝胶成像分析系统（上海天能科技有限公司）；Trans-Blot SD半干转印槽（BioRad）；PowerPac HC电泳仪（Bio-Rad）；Mini-Protean Tetra小型垂直电泳槽（Bio-Rad）。
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护骨胶囊含药血清制备
SD大鼠随机分为空白对照组和药物组，每组6只，分别给予0.9%氯化钠溶液和护骨胶囊药液（取护骨胶囊内容物，以ddH2O配制为97.2g/L的药物溶液），每天上午9：00按10mL/kg灌胃1次，连续7d。末次灌胃给药1h后心脏取血并分离血清，同组血清混匀、过滤除菌后分装，置-80℃冰箱保存备用。实验时将空白血清及含药血清以无血清成骨诱导培养基（含10mmol/L β-甘油磷酸钠、10-8mol/L地塞米松、50mg/L维生素C的DMEM高糖培养基）配成所需浓度。
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成骨细胞培养与鉴定
采用酶消化法分离培养成骨细胞：SD大鼠乳鼠处死后经75%乙醇浸泡消毒10min，在超净台内分离颅骨，用PBS缓冲液中清洗并刮除结缔组织和骨膜，直至骨头发白，剪碎骨片后加入胰酶（0.25%Trypsin-EDTA）溶液消化15min，弃去消化液，再加入Ⅰ型胶原酶溶液（Ⅰ型胶原酶：PBS=15mg∶10mL）消化2次，37℃孵育1h，400×g离心10min后弃去消化液。以含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基重悬细胞并转移至培养皿中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。每2d换液1次，待细胞生长至90%融合时胰酶消化传代，以1.0×105/mL接种于培养皿中，从P2代细胞开始使用成骨诱导培养基培养。取P3-P5代细胞用于各项实验。细胞接种于6cm×6cm培养皿中，培养24h细胞贴壁后弃去培养基，ddH2O洗3次，95%乙醇固定10min后按偶氮偶联法碱性磷酸酶染色试剂盒说明书步骤进行染色，倒置显微镜下观察拍照。
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Cell Counting Kit-8（cck-8试剂盒）测定细胞增殖
细胞以2×104/mL的密度接种于96孔细胞培养板，每孔100μL（弃周围一圈，改加PBS），37℃、5%CO2培养箱内培养24h后，更换5%、10%、20%空白血清或护骨胶囊含药血清培养基，各组各浓度均设5个复孔，给药培养24h后，每孔分别加入10μL CCK-8试液，37℃培养箱中孵育2h后，在酶标仪450nm波长处测定光密度值。
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细胞内碱性磷酸酶活性测定
细胞接种、分组给药方法同“4.”项，给药培养24h后，按碱性磷酸酶试剂盒说明书操作，在酶标仪520nm波长处测定光密度值。
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逆转录-PCR测定mRNA表达
细胞以1.0×105/mL的密度接种于10cm×10cm培养皿中，24h后更换10%空白血清或护骨胶囊含药血清培养基，37℃，5%CO2培养箱内培养24h后以Trizol提取总RNA，按PrimeScriptTM RT-PCR Kit试剂盒方法逆转录合成cDNA。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列见表1。扩增反应条件为：94℃变性30s，X℃退火30s（α-ENaC基因退火温度X为58℃；各成骨功能指标基因退火温度X为54℃），72℃延伸1min，共进行30个循环，以4℃结束循环。RT-PCR产物以2%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统拍照后以Image J软件测定目的条带灰度值，与内参β-actin灰度值比较，相对定量。
9
Western blot测定蛋白表达
细胞以5×105/mL的密度接种于10cm×10cm培养皿中，24h后更换10%空白血清或护骨胶囊含药血清培养基，37℃、5%CO2培养箱内培养24h后RIPA蛋白抽提试剂提取总蛋白，按BCA蛋白定量试剂盒方法测定各组蛋白浓度。各组取等量蛋白经12%SDS-PAGE电泳后转膜1h，经TBST洗膜10min×3次后用含5%脱脂奶粉的TBST溶液摇床轻摇封闭2h，再用TBST洗膜5min×3次后加入一抗，4℃摇床轻摇过夜，次日室温孵育1h，TBST 洗膜10min×3次后加入含5%脱脂奶粉的TBST溶液（1∶1 000）稀释二抗（辣根过氧化物酶标记的多克隆山羊抗兔IgG），4℃摇床孵育1h，TBST 洗膜10min×3次，经曝光、显影、定影后获得蛋白胶片，凝胶成像系统拍照后以Image J软件测定目的条带灰度值，与内参GAPDH灰度值比较，相对定量。
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统计学方法
所有参数均用均数±标准差形式表示，以SPSS 19.0软件进行统计分析，LSD-t检验法比较组间的变量差异，P<0.05表示差异有统计学意义。
二
结果
1
成骨细胞的碱性磷酸酶染色鉴定
原代成骨细胞贴壁前呈均匀透亮的球形，培养12-24h开始伸展贴壁，48-72h贴壁完全，呈饱满的三角形或梭形，10d左右细胞融合成片，大多呈多角立方形，有长短不一的突起，，轮廓清晰，呈圆形或椭圆形。碱性磷酸酶染色（偶氮偶联法）呈阳性：细胞核为较深的蓝紫色，细胞膜和胞浆浅蓝紫色，且可见胞浆中有许多棕褐色颗粒。
2
护骨胶囊对成骨细胞增殖的影响
护骨胶囊含药血清（5%，10%）能显著促进成骨细胞增殖，且含药血清浓度为5%时成骨细胞增殖率最高；与5%空白血清组比较，10%、20%空白血清对细胞增殖呈现抑制作用（P＜0.05）；扣除空白血清影响后，含药血清组的促增殖作用与含药血清浓度呈强线性负相关（r=0.990，P<0.05）。
3
护骨胶囊对成骨细胞分化的影响
10%、20%护骨胶囊含药血清能明显促进成骨细胞分化（P＜0.05），且含药血清浓度为20%时促分化作用最强。与5%空白血清组比较，20%空白血清亦表现出促进细胞分化的作用（P＜0.05）；扣除空白血清影响后，浓度为10%的含药血清促分化能力最强。
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护骨胶囊对成骨功能指标基因和α-ENaC基因mRNA表达的影响
PCR产物经电泳检测，分别得到4条与Coll-Ⅰα、ALP、OPN和α-ENaC基因大小一致的特异性片段（490bp、500bp、446bp、429bp）。经Image J软件测得灰度值结果表明：10%护骨胶囊含药血清能明显上调成骨细胞各成骨功能指标基因和α-ENaC基因的mRNA表达（P＜0.01）。
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护骨胶囊对成骨功能指标基因和α-ENaC基因蛋白表达的影响
Western blot方法检测成骨功能指标基因Coll-Ⅰα、ALP、OPN和α-ENaC的特异性蛋白条带，经Image J软件测得的灰度值结果表明：10%护骨胶囊含药血清组中各基因的蛋白表达量明显高于10%空白血清组（P＜0.01）。
三
讨论
护骨胶囊立足于中医学“肾主骨”的观点，以补肝肾、益精血、调理阴阳为治则，辅以活血止痛、强筋健骨之法配伍十余味中药组方而成，是临床治疗骨质疏松症的常用中药制剂，其不仅能降低绝经后骨质疏松症的高骨转换率，亦可显著缓解患者的腰背部疼痛，原发性骨质疏松症患者服用药物后骨密度明显增加，腰椎部疼痛、胫膝酸软等症状改善，说明护骨胶囊能促进成骨细胞增殖和分化、增强成骨功能，有利于新骨形成和提高骨质量，但具体药理作用机制尚未完全明确。中药药理研究中，为更好地模拟药物在机体内的变化，尽量避免因中药本身复杂性及机体吸收与代谢不同而导致在体与体外实验结果不一致的情况，通常会选用含药血清进行体外干预实验，即血清药理学方法。因此，与李宝红等直接将护骨胶囊干膏粉作用于成骨细胞不同，本研究采用血清药理学方法，将护骨胶囊给大鼠经口灌服给药7d后采血分离含药血清，代替护骨胶囊原药溶液加入体外培养的大鼠成骨细胞体系中，尽可能克服复方中药体外直接用药实验的多变量干扰因素，使实验条件更接近于体内环境，更有利于阐明护骨胶囊对成骨功能的影响及其药理机制。
实验结果表明，与同浓度空白血清组比较，护骨胶囊含药血清在5%和10%浓度时具有明显的促增殖作用，在10%和20%浓度时具有明显的促分化作用，综合考虑后选择10%血清浓度进行后续的逆转录-PCR及Western blot实验，这也与多数研究者对血清药理学血清添加浓度的看法一致。此外，空白血清组血清以不同添加量作用于成骨细胞就会产生不同的效果：与5%血清浓度比较，10%和20%血清浓度明显抑制细胞增殖，这可能是血清浓度增高时其中所含细胞毒性物质绝对量增多所致；而在细胞分化实验中20%血清浓度表现出最强的促进作用，这可能与高浓度血清中携带的促成骨分化因子浓度更高有关。成骨细胞骨形成功能的减退是老年性骨质疏松症的重要发病环节之一，因此对成骨细胞功能的调节也是抗骨质疏松药物研究的主要内容。在体外培养系统中成骨细胞的表型发育与其在体内的发育分化相似，均要经历细胞增殖、细胞外基质形成与成熟、基质矿化3个时期，本研究选择了分别代表3个阶段成骨细胞活性的Coll-Iα、ALP和OPN基因作为特异性检测指标，观察护骨胶囊含药血清作用下它们表达情况的变化，间接反映成骨细胞的功能。实验结果表明护骨胶囊含药血清能显著上调成骨细胞上Coll-Iα、ALP和OPN基因mRNA和蛋白的表达，同时，护骨胶囊含药血清作用下成骨细胞上α-ENaC的表达量亦显著提高，与成骨功能指标基因表达水平的变化趋势一致，结合本课题组对ENaC调节骨代谢研究的前期实验基础，推测护骨胶囊可能通过ENaC基因介导的细胞信号通路调节成骨细胞的活性和功能，以促进骨形成的方式发挥其“补肝肾、益精血、调理阴阳，辅以活血止痛、强筋健骨”之临床疗效。
结语
综上所述，护骨胶囊含药血清对大鼠成骨细胞的增殖分化以及骨形成有促进作用，其促成骨作用可能与水盐代谢关键蛋白ENaC的调节有关。但护骨胶囊作为复方中药，具有多途径、多靶点的调节机制，要完全明确其药效机制还需要大量的后续实验工作。
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