日粮阴阳离子差对围产期奶牛酸碱平衡、血浆钙和抗氧化应激及泌乳性能的影响

摘要：研究不同水平日粮阴阳离子差（dietary cation-anion difference，DCAD）对围产期奶牛酸碱平衡、血浆钙和抗氧化应激及产后生产性能的影响。选用39头经产（2胎）预产前28d、体重、年龄相同或相近的荷斯坦奶牛，按单因子随机区组试验设计分为3组，每组13头，分别饲喂DCAD为+175（对照组）、-35（试验1组）、-183（试验2组）的日粮。

试验持续60d，预饲期10d，正试期50d。低DCAD水平通过在日粮中添加阴离子盐配制。结果表明：降低DCAD水平可降低尿液pH（7.6、6.7、6.3，P<0.05），提高血浆钙水平（9.0、9.6、10.2mg/dL，P<0.05）；但对血浆抗氧化应激指标（MDA、SOD、CAT、H2O2）均没有显著影响（P>0.05）。

奶牛产后奶产量和奶成分不受产前DCAD水平的影响（P>0.05）。由此可见，降低围产前期奶牛DCAD水平可降低尿液pH值，有利于维持血钙稳恒；对抗氧化应激能力没有影响。

关键词：日粮阴阳离子差；血钙；抗氧化应激；围产期奶牛

围产期是奶牛生理阶段的一个特殊时期，此时奶牛经历“干奶-产犊-泌乳”的生理应激，内分泌紊乱，常常处于氧化应激状态（Castillo等，2005；Turk等，2008；熊桂林等，2010；Sharma等，2011），可导致机体免疫功能和炎症应答能力的下降，对机体健康具有明显的负面效应。通过营养学途径改善围产期奶牛健康状况是奶牛营养学研究的热点之一，对提高其泌乳性能具有积极的意义。

从目前的研究报道来看，添加维生素、微量元素、微生态制剂是用来提高机体抗氧化应激能力的常用方法，多集中在单胃动物（孙涛等，2012；谢全喜等，2012；陈恒灿等，2011）和水生动物上（潘瑜等，2012；曹春燕等，2012；白东清等，2011）；而对反刍动物，尤其是围产期奶牛的报道并不多见。

本课题组前期研究发现，降低DCAD水平可提高血钙浓度，降低产后疾病发生率（产乳热、低血钙、胎衣不下等），改善奶牛健康状况（吴文旋等，2006；Wu等，2007；Wu等，2008；吴文旋和李胜利，2011）。该方法已被推荐在奶牛营养实践中推广应用（USDA，2007）。但目前鲜见DCAD对奶牛抗氧化应激影响的相关报道。

据此，本文以围产期奶牛为研究对象，研究不同日粮DCAD水平对其酸碱平衡、血浆生理生化指标及产后生产性能的影响，重点是探讨血浆抗氧化应激指标对低DCAD水平的响应，为改善围产期奶牛氧化应激状态提供技术积累和科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

选用39头预产前28d、体重（600±20kg）、年龄（4~5year）接近的经产（2胎）荷斯坦奶牛，按单因子随机区组试验设计分为3组，每组13头，分别饲喂对照组（基础日粮）、试验1组（基础日粮补饲400g阴离子盐）、试验2组（基础日粮补饲700g阴离子盐）。阴离子盐购自Animate公司，用来降低DCAD水平。试验持续60d，预饲期10d，正试期50d。各组奶牛日粮DCAD水平预定分别为+150、0、-150。由于日粮结构有所变化，实测DCAD水平与预定水平略有偏差（表1）。

表1 围产前期奶牛日粮组成及营养水平

1.2 饲养管理

日粮采用TMR（全混合日粮搅拌车，意大利某公司生产）饲喂，自由饮水。饲喂时将阴离子盐和TMR混合均匀，饲喂时间分别为8：00和15：00。每组试验牛群集中在一个单独的运动场统一饲养管理，产犊后停喂阴离子盐转入产房挤奶，开始饲喂泌乳期日粮。

1.3 样品采集与指标检测

1.3.1 DCAD

从预饲期开始至试验结束，每周采集日粮样品2次，最后混匀后经四分法缩样，烘干、粉碎过40目筛制备成分析试样检测常规养分：CP、NDF、ADF、Ash。Na、K采用原子吸收法测定（AA-7003，北京某科技公司），Cl采用AgNO3滴定法（GB/T6439-92）测定，S采用硝酸镁法（GB/T17776-1999）测定。DCAD=Na（%）/0.0023+K（%）/0.0039–Cl（%）/0.00355–S（%）/0.0016。

1.3.2 尿液pH

经预饲期适应阴离子盐进入正试期后，每天抽测尿液pH。奶牛排尿后，立即用pH精密试纸（6.4~9.0：杭州某特种纸业有限公司；5.4~7.0：上海试剂某厂）蘸取尿样，与标准比色卡对比测定。

1.3.3 血浆生理生化指标

试验预定每周采血一次。用经肝素钠溶液浸润的一次性无菌注射器（江西某医疗器械集团有限公司）从尾静脉采血10mL，小心转入塑料管内，3000r/min离心15min，吸取上层血浆，-20℃冰箱保存，用于实验室检测血浆Ca和氧化应激指标：丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、过氧化氢（hydrogen peroxide，H2O2）。以上试剂盒均购自南京某生物工程研究所，检测仪器为Thermo酶标仪，分析方法参照试剂盒说明书进行。

1.3.4 生产性能

从预饲期开始，记录各组奶牛日粮投喂量与剩余量，计算头均日采食量。

分别在奶牛产犊后第7、14、21、28d测定奶产量，并在当天按上午、下午产奶量比例为6：4的泌乳规律，采集乳样100mL，测定乳脂率（fat）、乳蛋白率（protein）（UL80AC型全自动乳成分分析仪，杭州某科技有限公司）。测定前，将奶样置入40℃温水浴中摇匀。

1.4 数据分析和统计

试验数据采用SAS9.2软件进行分析，调取GLM模型，按照随机区组有重复数据程序处理数据。采用Duncan’s法进行多重比较，各处理组间差异显著性水平定为P<0.05。

试验过程中，对照组3头、试验1组4头、试验2组5头奶牛因受分组应激大、早产、严重疾病等原因而被淘汰，其数据不列入统计范畴，即对照组、试验1组、试验2组奶牛样本量分别为10、9、8。

试验以周为时间段，将采血时间分为>-21d、-21~-15d、-14~-8d、-7~-1d、0~7d、8~14d、15~21d、>21d共8个时间段血样进行分析。

2 结果

2.1 尿液pH

由图1可见，奶牛尿液pH随着DCAD水平的降低而降低，由对照组的7.6（±0.61）分别降至试验1组、2组的6.7（±0.65）、6.3（±0.91），降低了13.4、20.6%，差异显著（P<0.05）。

图1 不同水平DCAD日粮对奶牛产前尿液pH的影响

2.2 血浆生理生化指标

2.2.1 血浆钙

由表2可知，在产犊前后的一段时间，各组奶牛血浆钙水平均有所下降，低于试验开始时的水平，但两试验组均高于对照组。降低DCAD水平影响血浆钙水平的效应主要表现在-7~-1d、0~7d、8~14d这三个时间段，试验2组显著高于对照组，差异显著（P<0.05）；也高于试验1组，差异未达显著水平（P>0.05）。从整个试验期来看，对照组、试验1组、试验2组血浆钙含量依次升高（9.0：9.6：10.2mg/dL）；试验2组显著高于对照组（P<0.05），与试验1组差异不显著（P>0.05）。

表2 不同水平DCAD日粮对围产期奶牛血浆Ca的影响

注：同行数据肩标不同字母（P<0.05）。下同。

2.2.2 抗氧化指标

2.2.2.1  MDA

奶牛血浆MDA水平不受DCAD的影响（表3），各时间阶段内差异均不显著（P>0.05）。不同水平DCAD日粮对整个试验期血浆MDA的影响也不明显，差异不显著（2.9、3.0、2.9nmol/mL，P>0.05）。

表3 不同水平DCAD日粮对围产期奶牛血浆MDA的影响

2.2.2.2 SOD

与MDA类似，日粮添加阴离子盐对围产期奶牛各时间段内血浆SOD的影响也不大（表4），差异均不显著（P>0.05）。整个试验期血浆SOD水平也不受DCAD的影响（68.0、61.7、66.5U/mL，P>0.05）。

表4 不同水平DCAD日粮对围产期奶牛血浆SOD的影响

2.2.2.3 CAT

由表5可见，低DCAD日粮除可显著增加围产期奶牛产后8~14d血浆CAT水平外（P<0.05），其余时间段差异不显著（P>0.05）。日粮添加阴离子盐对整个试验期奶牛血浆CAT差异也不显著（2.0：2.2：2.1U/mL，P>0.05）。

表5 不同水平DCAD日粮对围产期奶牛血浆CAT的影响

2.2.2.4 H2O2

产前饲喂低水平DCAD日粮对围产期奶牛血浆H2O2差异不显著（P>0.05，表6），对整个试验期奶牛血浆H2O2的影响也很小，差异不显著（53.5、56.4、57.9mmol/L，P>0.05）。

表6 不同水平DCAD日粮对围产期奶牛血浆H2O2的影响

2.3 生产性能

2.3.1 干物质采食量

在预饲期，试验组日粮中添加阴离子盐后，少数几头奶牛由于不适应其味道，引起采食量下降。对此，我们除逐渐增加阴离子盐的用量，将阴离子盐在精料中充分混匀外，还采取不间断将TMR推向奶牛的措施，促进其采食。经过几天的适应后，这些奶牛均能恢复正常采食，基本能采食完全所供饲粮。对照组、试验1组、试验2组干物质采食量（DMI）分别为11.4、11.8、12.1kg/h.d。

2.3.2 产奶性能

各组奶牛奶产量差异不显著（21.5、21.6、21.9kg/h.d，P>0.05），试验2组略高于对照组0.4kg/h.d，提高程度有限。各组奶牛乳脂（3.4、3.5、3.5%，P>0.05）和乳蛋白含量（2.8、2.9、2.9%，P>0.05）也基本不受产前DCAD水平的影响。

3 讨论

3.1 日粮阴阳离子差对奶牛尿液pH的影响

正常情况下，奶牛尿液pH维持在碱性状态（8.0以上）。降低日粮DCAD水平，具有酸化日粮的效应，可诱发轻度代偿性代谢酸中毒，衡量这一现象的主要表现是尿液pH下降至5.5~6.5（Spanghero，2002）。这一调控措施，已经得到众多前人文献的认同（Goff，2000；DeGaris等，2010；Seifi等，2010；Grunberg等，2011；Muscher等，2011）。

用来解释这一现象的是加拿大学者提出的强离子差理论（Stewart，1983）：外源添加阴离子后可增加血液中阴离子（Cl-，S2-）的浓度，这将使肾脏排出多余的Cl-、S2-，此时尿液中H+增加，导致降低尿液pH。

本课题组前期研究结果也表明，日粮添加阴离子盐可降低奶牛尿液pH（吴文旋等，2006；Wu等，2007；Wu等，2008；吴文旋和李胜利，2011）。本研究也观察到了相同的现象，即奶牛尿液pH随DCAD水平的降低而降低。

3.2 日粮阴阳离子差对奶牛血浆生理生化指标的影响

3.2.1 血钙

Block（1984）通过持续2年的交叉试验发现，降低DCAD可增加奶牛血钙水平、降低产乳热发生率，提高奶产量。自此，国内外开展了大量相关试验。这些研究表明，对经产奶牛而言，降低DCAD水平是提高血钙浓度的有效途径（Gelfert等，2007；Charbonneau等，2009；Oba等，2011），并被美国农业部推荐在生产中广泛使用（USDA，2007）。

目前，这一机理尚未明确，广泛认可的解释是低DCAD酸化日粮后，增强了奶牛肠道的钙吸收能力，但其分子作用机理尚未明确，成为奶牛营养学界致力解决的课题。已知钙以跨细胞膜的途径在肠道吸收，钙结合蛋白（calcium binding protein-9KDa，CaBP-D9k）、瞬时性受体电位通道香草酸受体6（transient receptor potential cation channel，subfamily V，member 6，TRPV6）、维生素D受体（VDR）是调控这一途径的限速大分子。

一般来说，CaBP-D9k、TRPV6、VDR的表达水平越高，意味着钙的吸收越高。这提示，低DCAD日粮可能正是上调这3个基因的表达水平而增强钙的吸收。为此，本课题组以孕鼠为模式动物，已研究了不同水平DCAD对其肠道CaBP-D9k、TRPV6、VDR表达水平的影响。结果表明，与高DCAD日粮相比，低DCAD日粮可提高血钙水平，增强CaBP-D9k、TRPV6在肠道的表达水平。

可以相信，该成果是推进阐明低DCAD有效维持血钙稳恒机制的有力证据。以此为基础，本课题组目前正在筹划低DCAD对围产期奶山羊肠道CaBP-D9k、TRPV6、VDR表达水平的试验。鉴于奶山羊与奶牛同属草食型反刍动物，并在日粮组成、解剖生理、代谢过程等方面具有很高的相似性，可以预见这一试验成果，可为明确低水平DCAD日粮防治奶牛产乳热的机理奠定积极的基础。

3.2.2 抗氧化指标

体内过高的自由基水平是产生氧化应激的直接原因。自由基可通过生物膜中不饱和脂肪酸的过氧化反应产生脂质过氧化物，破坏细胞膜的生物学构象，使膜蛋白的功能丧失，降低机体免疫应答能力，进而降低生产性能。围产期奶牛由于所处特殊的生理阶段，引起营养物质摄入不足、能量代谢加快、内分泌激素急剧变化，经历明显的生理应激，而更易受氧化应激的影响（Colitti和Stefanon，2006；Sordillo和Aitken，2009）。

奶牛发生氧化应激反应还与酒精阳性乳间存在一定的关联性（王林等，2006）。常用来反映氧化应激的血液指标有总抗氧化能力、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶、丙二醛等。其中，总抗氧化能力是用来综合衡量机体抗氧化系统功能状况的指标，是反映机体对外来刺激的代偿能力和自由基代谢状态的表征。

过氧化氢酶作为生物体内重要物质，主要参与活性氧代谢过程。谷胱甘肽过氧化物酶是机体内一种重要分解过氧化物的重要分子，具有保护细胞膜结构完整的功能，可阻止自由基对机体的危害作用。

SOD是清除体内超氧阴离子自由基的重要因子和参与转换氧自由基的过氧化物酶，可保护细胞免受损伤，平衡机体氧化与抗氧化反应。MDA是氧自由基引起的脂质过氧化反应的终产物，可间接反映机体内氧自由基代谢的状况、机体组织细胞受自由基攻击的程度及脂质过氧化程度。

如前所述，增强奶牛抗氧化应激能力，是目前奶牛营养学研究领域的重要领域，国内外学者都在进行有益的尝试，主要的措施是在日粮中添加抗氧化剂（维生素E、维生素C、类胡萝卜素、多酚、微量元素等）。其中，根据试验开展的便利性，以泌乳奶牛为试验动物的研究最为常见。

许宗运等（2007）报道，酵母硒可提高奶牛抗氧化应激能力，Wang等（2010a）在泌乳早期奶牛日粮中添加惰性脂肪，提高了抗氧化应激能力；也有研究指出，当日粮精料水平为55%时，奶牛血液抗氧化应激能力最强（侯志高等，2008）。而崔海等（2011）指出，十二指肠灌注十八碳脂肪酸对奶牛抗氧化应激能力影响不大；吴文旋（2012）研究表明，添加过瘤胃胆碱对增强奶牛抗氧化应激的效果不明显。

与泌乳奶牛相对应，目前的文献对提高围产期奶牛抗氧化应激能力的报道并不十分常见。Bouwstra等（2008）报道，添加维生素E虽然对围产期奶牛分娩时的抗氧化应激能力没有显著效果，但有利于奶牛产后抗氧化应激状态的恢复。

最新的研究表明，添加抗氧化剂AOX（主要成分为乙氧喹啉和BHT）和饲喂低能水平日粮可在一定程度上改善不饱和脂肪酸对奶牛血液氧化应激的影响（Wang等，2010b）。这可能是通过清除自由基、节约内源性抗氧化酶系起作用的（Vázquez-Añόn等，2008）。

在以生长山羊为试验动物的研究中，本课题组发现降低DCAD水平有利于抗氧化应激能力（Wu等，已录用）；而在本试验中，奶牛抗氧化应激能力不受DCAD水平的影响，效果不明显，绝大多数指标差异均不显著（P>0.05）。其原因可能是，山羊正处于生长期，日粮充足，体内的生理应激不明显，产生的自由基经自身消除后，剩余的数量不足以使机体产生氧化应激状态；而围产期奶牛需要经历“干奶—产犊—泌乳”的明显生理应激，内分泌变化急剧，代谢紊乱，掩盖了DCAD的作用。

另一方面，这也可能与本试验所用奶牛奶产量较低有关，因为与奶产量较低的奶牛相比，高产奶牛的血液脂质过氧化物水平显著升高，促进了氧化应激状态的发生（Löhrke等，2005）。不过，这也从侧面提示围产期奶牛需要更加精心饲养，需要寻找其它更有效的抗氧化应激措施，才能更为有效地保障奶牛健康。

3.3 日粮阴阳离子差对奶牛生产性能的影响

3.3.1 采食量

通过添加纯阴离子盐降低DCAD水平，会引起日粮适口性变差，降低奶牛采食量（Oetzel和Barmore，1993；Vagnoni和Oetzel，1998）或延长采食时间（Wang和Beede，1992），因为纯阴离子盐具有苦涩味、易吸潮。本试验中，两处理组奶牛采食量未降低，基本不受影响，这与本试验所用的阴离子盐混入糖蜜和DDGS，制粒等加工有关，部分掩盖了纯阴离子盐的不良味道。

3.3.2 奶产量、奶成分

作为奶牛最为重要的生产性能，奶产量一直广受重视，但已发表的研究报道结果不尽相同。Block（1984）指出，在围产前期饲喂给奶牛阴离子盐，可提高奶产量7%。李斌等（2003）饲喂干奶牛阴离子盐，也提高了奶产量。但Joyce等（1997）研究指出，围产前期饲喂阴离子盐对于奶牛分娩后的产奶量和乳成分没有显著影响。

吴文旋等（2006）、吴文旋和李胜利（2011）研究指出，产前降低DCAD水平对奶产量和乳成分没有显著影响。Moore等（2000）、Roche等（2003）也报道DCAD对奶牛乳蛋白含量无显著影响。本研究中，随着日粮DCAD水平的降低，各组奶牛产后奶产量，乳蛋白、乳肪率的差异不大。这可能与泌乳日粮构成与牛场管理等试验条件不同有关。

4 结论

本文以围产期奶牛为试验动物，研究了不同水平DCAD日粮对其酸碱平衡、血浆生理生化指标及生产性能的影响，结论如下。

4.1 降低DCAD水平可降低尿液pH；提高血浆钙水平，有利于维持血钙稳恒。

4.2 产前日粮添加阴离子盐对血浆抗氧化应激指标（MDA、SOD、CAT、H2O2）没有显著影响。

4.3 产前降低DCAD水平对奶牛产后奶产量和奶成分没有显著影响。