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西班牙肾脏病研究系统(REDinREN)生物样本库样本质量保证(QA)与处理过程(全文)

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生物样本库BS小组


摘要:

背景:生物样本库是连接基础医学、转化医学、临床研究、临床治疗等的重要桥梁与平台,其存储的高质量的生物样本是评估疾病的组织学特性、研究患者基因型、转录组学以及蛋白质组学的重要来源。本文所报道的西班牙肾脏病研究系统(REDinREN)生物样本库,其内储存着来自西班牙全境内70余家肾脏病中心、涵盖了多种类型肾脏疾病、约5,450位患者的76,500份新鲜冻存样本。 

目的:参照ISO 9001:2008 国际标准,严格对西班牙肾脏病研究系统生物样本库内所储存样品的储存条件以及样品处理流程进行质控分析,并报告质评结果。

研究设计:采用了两种质评方法:(1)系统性的,即提取外周血单核细胞(PMBC)并纯化细胞核酸,检测该提取方法的可行性;(2) ad-hoc,即检测所提取的冻融PMBC的生物活性,验证DNA提取过程的可重复性,以及所提取核酸的完整性和核酸功能。

方法与结果: 结果证实,采用Ficoll细胞密度梯度离心方法分离纯化PBMC,其分离效果具有可重复性,冻存的PMBC生物活性大于90%以上,而且大部分提取的DNA(2,328例)和RNA(78例)样本A260/280比率显示纯度适宜。我们采用琼脂糖凝胶电泳法检测DNA的完整性,聚合酶链式反应(PCR)扩增得到β球蛋白长度分别为1327bp和989bp的两个片段。 DNA质量保证的标准是PCR扩增至少获得β球蛋白三个段带。进行RNA完整性检测,96例样本中87例RNA样本完整性系数(RIN)大于7以上。进一步通过QPCR及RT-PCR检测了β-actin和GAPDH的表达,验证前期PCR扩增的正确性。样本长期保存及操作过程中时间延迟并没有影响检测样本的质量,所得的实验结果均具有可重复性。

结论:结果表明,我们所保存的外周血单核细胞样本、提取的DNA、RNA样本质量均达到质控标准并能满足生物研究的需求,并能够长期保存。


前言

疾病的起源是个复杂的、受多因素调控的过程,在其发生发展过程中,人类个体的基因型特征、习惯的生活方式以及所处的生态环境等等都可以影响疾病的进程。然而,到目前为止,人类对疾病的明确病因知之甚少,亟待进一步的提高。要了解这些多因素之间的相关关系,研究者建立一个大型的、可以良好保存生物样本的样本库就至关重要。所保存的生物样本要达到一定的科研标准,不仅要能够满足所进行的生物检测所需的标本质量要求,而且如果有新的科研技术被发现时,所保存的标本质量能够基本满足新型检测的质量标准。总而言之,建立一套完善的基础研究体系,从而能够方便的验证科学假想或者对疾病建模有重大意义。

生物样本库就是这样一个可以对患者生物样本及对应的临床患者信息进行分类、归档,处理,存储样本以期用于后续生物学研究的设施体系。保存良好的冻存样本是检测患者基因型、转录组型、蛋白质组型以及代谢功能的最理想样本,要想对组织核酸、蛋白质、代谢产物等进行准确的分子分析,提取这些物质的原始样本的保存条件就至关重要,因为如果样本存在降解、样本中存在其它杂质,或者存在酶类抑制剂都可以对检测结果造成干扰。因此,为了满足大规模的转录组学筛选研究,就必须有足够数量的、保存质量良好的生物样本随时待用。生物样本库中的样本要满足这些要求,严格的标准化质控相当重要。当然,质控的标准要依据所保存的生物标本类型的不同而有不同要求。

目前,很多地方生物样本库都已经有自己的质控标准,而且,对一些特定类型样本储存的质控标准,大家已经基本达成共识,比如,对于DNA和RNA样本,确保其完整性和纯度是最重要的。对RNA样品,其纯度要根据其在260nm和280nm处的吸光光度值来判定,其完整性要通过琼脂糖电泳或显微微阵列来检测观察其在28s和18s大小的两条核糖体带。此外要检测RNA的完整性,还要计算RNA完整性系数(RIN),而且,所提取的RNA在经过逆转录之后,通过RT-PCR方法要能扩增出完整的基因。DNA样品的完整性的检测方法跟RNA基本相同,不过,其完整性是通过观察琼脂糖电泳后存在的一条完整的不弥散降解的高分子量条带来检测,也可以通过PCR之后完整基因的扩增能力来进行验证。

对于血浆样品,其中特异性的生物标记物(例如转铁蛋白受体、抗坏血酸、K+、可溶性CD40L、促肾上腺皮质激素、血管内皮生长因子、以及基质金属蛋白酶-7)特别不稳定,对检测前环境的变化非常敏感。国际生物和环境样本库协会(ISBER)针对这类型的检测前环境变化评估标准已经出台了一本标准手册,基本达成共识。

最后,对于在DMSO中低温保存的外周血单核细胞,在经过反复冻融之后要检测生物活性,生物活性要求要大于80%。此外,HIV/AIDs网络协调委员会(HANC)也对PBMC质控标准提出要求,主要是针对每毫升血液中提取到的PDMC的数量而定,同时也要求在提取的PBMC样品中不能含有在血液样品经过长期保存之后可能会污染PBMC的CD15+粒系细胞。

西班牙肾脏病研究系统(REDinREN)生物样本库成立于2007年,其存储了可用于生物医学研究的各类肾脏病样本,是一个拥有质量保证的、有组织的、有严格标准要求的科技型机构。该机构隶属于西班牙Institutode Salud Carlos III (RD6/0016/0002),它的主要任务就是服务于肾衰的科学机制研究,机构所有一切活动均参照西班牙生物医学研究法律14/2007和皇室法规1716/2011,以及ISBER的实践操作指南来执行,而且,自从机构的创立起始,该机构同时也遵循个人信息保密守则、生物标本运输原则等等国家的其它一些法规条例。

REDinREN近年来所取得的成就包括它储存的生物样本不断扩增的广度以及覆盖面,所取得的样本覆盖全西班牙,而且涵盖的疾病种类以及样本数量都在不断递增。该机构遵循ISO9001:2008国际标准,而且也在西班牙生物样本库登记处进行了正式登记。对ISO9001:2008国际标准的有效遵循大大提升了机构的运行效率,不仅节省了接近70%的操作时间,而且处理的样本数量增加接近200%,特别是机构对将样本运输到各个下属科研机构的管理系统效率提升了近25%,得到了客户的极大认可。样本数量的不断增加完全得益于良好的操作流程系统。

在本文中,我们呈现了依据前文所提到的各类法律法规对我们生物样本进行质控检测的结果,同时也报道了根据样本以及操作系统的质控检测所得到的详细数据信息。样本质控,主要是检测了DNA与RNA的纯度,以及DMSO低温保存的PBMC生物活性。对于操作系统的质控,主要是DNA的提取流程。检测结果证实,我们提取的DNA与RNA,以及储存的PBMC可以用于进一步的肾脏病科学研究。


材料和方法

伦理批准

样本库的所有项目均经过西班牙肾脏研究生物样本库伦理委员会(注册号:0000931)的批准,对样本的处理均经过患者的书面知情同意,所进行的研究均遵循世界医学委员会人类实验伦理守则的最新版本。


样本类型与收集

本次质控所选用的样本,是从冻存在REDinREN生物样本库中的、来自全西班牙70余家肾脏疾病中心和血透机构5,450位病人的76,500份生物样本中挑选的。目前,我们保存了多种类型的生物样本,包括:血清、血浆、蛋白质、尿液、全血、DNA和RNA(-80°C保存)、以及活性外周血单核细胞(低温保存于-190°C)。每次提取血液样本时,会用EDTA采血管从每位肾脏病人采集5管全血,每管8ml。所采集的血液1管用于提取血浆、2管用于分离外周血单核细胞(提取包括DNA、蛋白质,和低温保存的细胞)、1管提取血清,还有1管提取PAX基因(采用新西兰、凯杰生物的血液PAX基因RNA试管)和提取总RNA。

所有血液样本的提取是由合作的医疗机构内部经过训练的工作人员采用无菌静脉采血管从患者的前臂肘静脉采集的,在适宜的温度(大多为4度)下遵循现有的生物样本运输相关法律法规在血液离体后24h内运送到我们生物样本库。每次采集的病人数目依据与合作医疗机构签订的协议的不同而决定,一般每次最多运送10例患者的标本。一旦样本到达生物样本库,工作人员会立即开始处理样本,尽量减少时间间隔,从他们接手样品到真正开始提取之间所用的时间间隔控制在2-24h范围内。


实施质控

本次生物样本库所进行的质控检测主要有两种类型:

一、系统性的检测。主要是检测采用Ficoll方法从外周血中分离的单核细胞的活性(2,724例),以及所提取的核酸的纯度(DNA 2,328例,RNA 78例)。

二、点对点检测。主要是检测冻融的PBMC的生物活性(10例),以及从PBMC中三次提取DNA以检测DNA提取操作的可重复性(15例),并且检测所提取核酸的完整性和功能(采用琼脂糖凝胶,DNA扩增β球蛋白基因30例,检测RNA完整性系数96例,检测DNA与RNA的功能30例)。

这些质控操作都是常规开展的,实施检测具体频率信息见表1.


表1  REDinREN内质控实施年份、实施频率、每次检测的样本数量、实施检测的次数,以及到目前为止所检测的样本总数量汇总,所有数据根据检测样本类型进行分组

PBMC:外周血单核细胞;qPCR:实时定量PCR;QC:质量控制;RIN:RNA完整性系数;RT-qPCR:反转录PCR;


样品筛选标准

点对点检测时,样品的筛选标准如下:

1)为了检测冻融的PBMC的生物活性,采用2条标准:所用的标本必须是已经冻存3年以上的而且保存有至少5个分管。同时,对于来自不同年份的两例标本会被随机选择进入检测。自从2013年开始,这套质控标准每半年会实施一次。

2)我们在不同的三天分别从12个病人标本上采集了三份PBMC细胞,并且另外富余至少8x10^6细胞量来提取DNA(所有的样品都是被冻存过的,包括5份在-190°C低温保存的PBMC标本)。

3)为了检测DNA的完整性与功能性,我们所用的样本是在不同年份都提取的6份DNA标本,标本采集的时间跨度达到8年之久,所有的DNA纯度A260/280值都在1.8-2.1范围。

4)为了检测RNA的完整性与功能,我们选用的样本也是采集时间跨度达到8年的不同年份保存的RNA样品,随机选用了6份样品进行琼脂糖凝胶和功能性检测,另外选择12份进行RIN检测。

对于1)-4)这4项质控检测,从2013年或者2014年开始,我们每4个月都会实施一次。(见表1)

表1内总结了所有进行检测的样品种类,检测实施的时间、频率,每次检测的样品数目,以及迄今为止,REDinREN生物样本库检测的样品总数量。

每种类型样品进行检测的数目是在2013年起遵照AENOR(西班牙标准化和规范化联合会)规范而定的,同年ISO 9001:2008标准也通过了认证,并在2014年和2015年分别进行了首次和第二次听证会。


PBMC分离和保存质量评估

PBMC的分离以及所分离细胞的活性检测

将使用EDTA抗凝采血管收集的2管全血使用PBS(购自Thermo Fisher Scientific)进行50%稀释,10ml稀释后的血液放置入20mL的Ficoll分层管(淋巴细胞分离体系,Rafer, Zaragoza, 西班牙)内,在室温下400g离心30分钟使血液分层,使用移液器小心的吸取含有PBMC的上层液,将分离出来的淋巴细胞使用PBS进行200g 离心10分钟以达到清洗目的,然后接下来进行了系列实验以检测分离的PBMC的活性。分离出来的淋巴细胞是使用Countess Automated细胞计数器(购自Life Technology, 英国)进行计数以及活性检测的,具体方法同前述。将最终提取的细胞沉淀分装成6份,每份大约4x10^6细胞量,然后进行低温保存。所保存的6份样品,其中3份用来提取DNA,另外3份提取蛋白质,这些DNA或者蛋白质只有在研究员科研项目需要,并明确要求提取时才能着手进行提取。

如果所检测的PBMC活性大于80%,所保存的该样品的所有PBMC细胞将全部被转移到液氮内进行-190°C低温保存(将细胞放在冻存管内,每个冻存管内8x10^6细胞,使用含有20%胎牛血清、10%DMSO的冻存液)。要注意:细胞冻存过程时温度要梯度下降,将冻存管放置在含有异丙醇的冻存盒内,首先在4°C预冷,然后在-80°C低温保存过夜,最后才能转移入液氮中长期保存。


检测冻融的PBMC的生物活性

将液氮中冻存的PBMC溶解后,使用含有10%胎牛血清、1mM谷氨酸、加了青、链霉素双抗的1640细胞培养基培养在37°C含有5%二氧化碳的孵箱中,培养基中不加其它生长因子。采用台盼蓝染液分别以刚刚冻融时为第1次,以后每隔24小时检测1次,连续14天检测细胞的活性,每次检测使用3个复孔。


DNA提取流程,以及所提取的DNA纯度、完整性以及功能检测

DNA提取,浓度以及纯度检测

从-80°C冻存的PBMC细胞沉淀中,使用Qiagen的DNA小提试剂盒依照试剂盒内说明书推荐操作流程提取DNA的样本,所有操作在QIAcube(Qiagen)核酸纯化机械化操作平台上进行。所提取的DNA使用Nano Drop(德国产)进行定量:DNA浓度是根据Nano Drop260nm处吸光值来计算,DNA纯度根据A260/A280比值计算,A260/A280比值在1.8-2.1之间时,认为DNA纯度适宜。


DNA完整性检测

通过1%的琼脂糖凝胶电泳分离方法进行的DNA的完整性检测,有以下两个步骤:首先是所有质控DNA样品分为两组:未经处理的,或者使用DNAse(20-30°C,15分钟)/加热(100°C,15分钟)进行变性处理的,其中变性过后的DNA样品是用于做DNA完整性检测的阴性对照条带。然后,将取得的DNA样品进行PCR反应,PCR特异性扩增管家基因beta-globulin的4条扩增子,4条扩增子长度分别为268、536、989、1327bp,所用的特异性引物见表2,所用的PCR酶购自(Biotools, Madrid, Spain)。PCR反应条件为:95°C预变性3分钟;95°C变性1分钟,55°C退火1分钟,72°C延伸1.5分钟,此阶段进行40个循环;最后72°C反应5分钟。然后将PCR产物用于琼脂糖电泳,凝胶使用1%浓度,凝胶电泳后使用 RedSafe(20,000; Promega, Madison, WI)进行染色,要求所检测样品至少能扩增出beta-globulin其中3条扩增子时方能被认为完整性检测合格。



表2  β-globulin扩增所用特异性引物列表


qPCR检测DNA功能

使用h LC FastStart DNA Master SYBR Green I 试剂盒( 购自Roche, Mannhein, Germany)进行qPCR扩增β-actin和GAPDH两个基因,每个DNA样品设置3个复孔,每个反应上样250ngDNA量。qPCR反应使用的两个基因引物:

GAPDH:(forward)5 ‘-TCC ACT GGC GTC TTC ACC-3’ 

         (reverse)5 ‘-GGC AGA GAT GAC CCT TTT-3’ .

beta-actin: (forward): 5 ‘-TCA CCC ACA CTG TGC CCA TCT ACG A-3’; 

                  (reverse):5 ‘-CAG CGG AAC CGC TCA TTG CCA ATG G-3’

qPCR反应使用ABI 7500操作体系进行,所用试剂为 7500 Fast real-time PCR System,所用仪器为 7500 Fast sequence detection software v1.3.1 ,PCR反应条件:50°C预加热2分钟,95°C预变性10分钟;95°C变性15秒,60°C延伸1分钟,此阶段进行45个循环。


RNA提取流程,以及所提取的RNA纯度、完整性以及功能检测

RNA提取,浓度以及纯度检测

使用从各个合作的医疗机构中收集的保存于PAX基因试管(购自Qiagen的,PAX基因血液RNA专用试管)的外周血全血样本提取RNA。本生物样本库使用的是购自Qiagen的PAX基因血液RNA提取试剂盒,依照试剂盒说明书推荐流程进行操作,全部操作在QIAcube机械化核酸纯化操作平台上进行。所提取的RNA样品保存于-80°C,当需要进行下一步科研实验时方取出。同样使用Nano Drop法检测RNA浓度,RNA纯度同样采用Nano Drop A260/A280比值进行计算。


RNA完整性检测

根据RIN(RNA完整性系数)来验证RNA的完整性,RIN检测通过西班牙Autonoma de Madrid机构内 Genomics of the PCM Foundation部门的Agilent 2100生物分析仪进行。RIN系数是通过对待检测样品进行电泳分离,进而根据所得的电泳图谱分析得到一系列参数,进而演算得出该样品RIN数值。RIN系数可以反映RNA质量:RIN 1代表完全性降解,RIN 10代表绝对的完整,将RIN 7设为决定提取RNA样品完整性适宜的阈值,当RIN大于7以上时,样品被认为完整度适宜。


RT-qPCR检测RNA功能

使用高通量cDNA逆转试剂盒将2ugRNA逆转成为cDNA,使用逆转所得的cDNA进行qPCR扩增内源性GAPDH与β-actin两个基因,每次反应分别设置三个复孔,每次上样250ng cDNA。GAPDH与β-actin特异性扩增引物序列同前,qPCR反应条件同前述DNA功能检测时的条件。


DNA提取流程质控

将PBMC从外周血分离之后,以每管至少4x10^6细胞量使用冻存管进行分装,将分装后的PBMC细胞冻存在-80°C,直到使用时取出。提取细胞DNA,然后采用前述过程检测DNA的浓度以及完整性,这种检测每4个月常规进行一次。同时计算变化系数(CV),CV计算公式:CV=标准差/平均值 X 100,标准差与均值计算自对同一批PBMC样品进行不同次测量时,每次测量的数值。


统计方法

采用描述性统计学方法检测实验中所得数值的分布规律。采用KS检验分析数据的正态性分布。当数据符合正态性分布时,例如当分析比较在PBMC实验操作以及进行DNA各种参数检测时人工耽搁的时间对实验结果的影响,采用配对样本t检测;当比较样本储存的时间对实验结果的影响时,因为此时不同样本储存时间大致符合正态性分布,采用ANOVA进行统计分析;所有进行正态性检测的样品数值采用平均数±标准差。当数据不符合正态性分布时,例如当分析存储时间差异与人工操作耽搁时间之间的相关性时,数据采用Kruskal–Wallis或者Mann–Whitney U检测进行统计分析,所有非正态性分布的数值采用中位数+可信区间(IOR)值表示。当p<0.05时,认为检测结果有统计学意义。


结果

活性PBMC分离过程质控

通过检测每毫升全血中可分离得到的活性PBMC细胞数进行PBMC分离过程质控。检测结果显示:2010年至2015年间,不同存储时间的样品所分离得到的平均活性PBMC细胞数量保持稳定,各时间点之间差异没有统计学意义(p=0.3637),如图1。具体一共检测了2724例标本,其2010年存储进入样本库的有181例,2011年的有868例,2012年902例,2013年359例,2014年255例,2015年159例,每毫升全血中能平均分离得到(3.17±1.12 )x 10^6 个活性PBMC细胞。此外,尽管在分离细胞时,在离心前人工操作耽搁的时间小于4小时的话,相比与耽搁时间大于24小时的样品,所分离得到的活性PBMC平均数量会更高一点,但是该差异却并没有统计学意义(4小时组样品:3.36 ±1.12, n = 523;24小时组:3.01 ±1.18, n = 2201。采用t-test统计分析结果:p = 0.469)。



图1 外周血中分离的PBMC质控。检测标准:每毫升全血中分离得到的活性PBMC细胞数量,以及细胞分离年份。所检测样本总数2724。下图内所标点代表每年平均数±标准差


从-190°C冻融的PBMC细胞复苏活性质控

如图2中所显示的是10个冻融PBMC样品的生物活性数据。从图中可以看出,在刚冻融之后即检测细胞的生物活性为96.5%,IQR在94.75-97.25范围,这就表示:-190°C冻存的过程并没有影响细胞的生物活性。在将PBMC复苏之后,连续培养14天,每天测量细胞的生物学活性,结果显示:从1-14天,每天的活性值均大于80%以上(80%为图2所标水平线,80%也是科研可接受的PBMC活性阈值,大于80%均可认为样本适宜可用)。在第14天时,样本的活性才下降至等于80%,其它均在80%以上。这10例经过冻存后的PBMC细胞样本中复苏后的细胞,其中活性细胞所占比例的中位数为84.5%(IQR值78.4-100)。我们计算了PBMC细胞在复苏并连续培养14天之后依旧存活的细胞比例,并且比较不同存储时间时,细胞比例的差异。其中,储存时间最长的样本,是在2007-2009年左右,其活性比例达到85%,IQR值83-87.5范围;储存时间最近为2010-2012年,活性比例83%,IQR值80.5-83%。采用 Mann–Whitney U 检测统计分析两组间的差异,结果显示差异没有统计学意义,p=0.056。这些结果提示:长时间的冻存并不影响PBMC细胞活性。此外,我们的检测结果显示,将前期处理样本时手工操作耽搁时间小于4小时,和大于24小时的PBMC细胞样本相比较,它们在冻融复苏并连续培养14天之后,依旧存活的细胞所占比例并没有明显差异。(p=0.383, Mann–Whitney U 检测)



图2 用10%DMSO所保存的PBMC细胞的活性。PBMC解冻并复苏后连续培养14天,从解冻当天起连续14天试用台盼蓝染色检测细胞活性。检测了10例冻存PBMC标本的活性。图内标点代表所检测所有样本的数值,bar值代表每天数据的平均值与可信区间(IQR)。水平线代表80%细胞活性


-80°C保存的DNA样本质控

我们结合DNA样品的纯度、完整性以及功能性共同说明DNA样品质量,其中样品完整性与功能是通过检测DNA样品扩增基因的能力来说明的。如图3A所示,为我们迄今为止所保存的所有DNA样品的检测浓度,共计2328例,这些样品浓度检测是根据存储入库的时间来进行分组的。检测结果显示:样本平均A260/A280比值为2.05±0.14,而且各个不同的存储时间组样本纯度并没有明显差异,结果提示:DNA样本存储时间长短对其纯度没有影响(p=0.063)。此外,对DNA样本前期处理时人工操作耽搁时间小于4小时,与耽搁时间24小时的样本进行比较时,结果显示其纯度并没与明显差异(4小时组:A260/A280均值:2.025±0.21,n=498;24小时组:A260/A280均值:2.059±0.18,n=1,830;t检验 p=0.338)。图3B显示的是两个代表性的DNA样品,是为检测DNA样品完整性而进行的琼脂糖凝胶电泳图谱,三个泳道分别是:未经处理的待测DNA样品,其看到的是一条高分子量的完整的DNA条带;已经另外两个泳道分别是经过DNA酶处理或者经过加热处理之后的阴性对照条带,这两个泳道DNA经过降解时候已经看不到条带或者只能看到很模糊的条带影。不过,我们在4.2%的样品(2/48)中,在琼脂糖电泳之后,也观察到部分降解的现象,如该图所示的第2例样本。然后,我们以提取的DNA为模板,通过PCR扩增了β-globin四个扩增子片段,共进行了30例样本检测,如图3C所示是一个很好的扩增出了β-globin全部四个扩增子的典型样本示例,4个扩增全部得到完整扩增,说明DNA样品的完整性极好。β-globin四个扩增子片段长度268bp到1327bp不等,四个扩增子长度各不相同,待检DNA样品要求至少能够扩增出其中3个条带,方能被认为是完整度适宜,可以被后续研究使用。在我们检测的30例样本中,其中26例扩增出3条及3条以上β-globin扩增子条带,其中:76.3%(n=23)扩增得到4条带,10%(n=3)扩增得到3条带;另外4个样本扩增得到2个条带。最后,我们以提取DNA为模板,通过qPCR扩增β-actin与GAPDH两个基因,双重检测DNA样本的完整性(如图3D,3E)。在被检测的30例样本中,扩增的到β-actin的ct值均数19.75(IQR 19.25-21.32),得到GAPDH的ct值均数22.37(IQR 21.91-23.18),这些结果都说明,所检测的DNA样本完整性适宜,可以被用于基因组学分析。而且,结果显示,样品储存的时间长短并不影响DNA的功能性(Kruskal–Wallis 统计学结果,β-actin组 p=0.239;GAPDH组 p=0.969)。此外,在DNA样本前期处理时人工操作耽搁时间小于4小时,与单个时间24小时的样本结果进行比较,显示基因扩增ct值组间没有明显差异(Mann–Whitney U 检测,β-actin组 p=0.440,GAPDH组 p=0.134)。



图3 使用QIAcube(Qiagen)从PBMC提取的DNA样本质控。(A)2328例DNA样本A260/A280吸光值,以及样本存储年份。图内点代表每年份平均值±标准差。(B)两份基因样本DNA琼脂糖凝胶电泳代表性图谱,三个泳道分别是:CT(未经处理的样本)、1(用DNA酶处理后的样本)、2(用加热100°C处理15分钟后样本)。(C)以DNA样本为模板,用四个反应管分别扩增β-globulin基因四个扩增子之后电泳图谱。(D,E)使用30份DNA样本为模板,PCR分别扩增β-actin(D)与GAPDH(E)基因,以及30例DNA样本的存储年份。图内点代表所研究的所有样本的个体数据,条带代表每年份的中位数加IQR值。


-80°保存的RNA样本质控

对RNA样品质量的质控,同样也是结合样品的纯度、完整性以及基因扩增能力来共同说明。如图4A所示,为我们目前为止提取的78例RNA样品的纯度值,RNA样品根据存储入库的时间进行分组。结果显示:代表RNA样品纯度的A260/A280值中位数为2.04(IQR 1.96-2.07),而且,存储时间的长短并没有影响RNA的纯度( Kruskal–Wallis统计分析,p=0.089)。此外,对RNA样本前期处理时人工操作耽搁时间小于4小时,与耽搁时间24小时的样本进行比较时,结果显示其纯度并没与明显差异(Mann–Whitney U 检验,p=0.374)。

通过RIN系数值来说明RNA的完整性。如图4B的左侧图显示,在2007-2015年间存储的96例RNA样品平均PIN系数在7.3-9.1范围内(8.19±0.92),其中87例样本RIN系数都在7以上或者等于7,这就说明长时间的冻存并不会明显破坏RNA样本的完整性(p=0.092)。



图4 采用PAX基因系统从外周血提取的RNA样本的质控。(A)78例RNA样本A260/A280吸光值,以及样本存储年份。(B)使用96例样本提取RNA,其RIN系数以及样本的存储年份。右侧图内是一例代表性RNA电泳图谱,上图RIN系数为9.9,是RNA完整性良好;下图RIN系数5.7,RNA完整性差。水平线代表RIN为7.(C,D)使用30份RNA样本,逆转录为cDNA,以cDNA为模板,PCR分别扩增β-actin(C)与GAPDH(D)基因,以及30例RNA样本的存储年份。(A-D)图内点代表所研究的所有样本的个体数据,条带代表每年份的中位数加IQR值。


最后,如图4C与4D,是我们使用RNA样本进行逆转录生成相应的样本cDNA之后,以cDNA为模板,进行qPCR扩增β-actin与GAPDH的统计结果图。在RNA样本前期处理时人工操作耽搁时间小于4小时,与耽搁时间24小时的样本进行比较时,两组间RIN中位数并没有明显差异(, Mann–Whitney U 检验,p=0.079)。所检测的30例样本中,β-actin扩增的中位CT值为20.04(IQR值18.2-20.86),GAPDH扩增中位CT值为21.0(IQR值19.0-22.71),这些结果均说明RNA样本完整性良好,可以被用于基因表达的检测分析。此外,研究结果也证实,RNA样本的存储时间长短并没有影响RNA样品质量( Kruskal–Wallis test检验,β-actin组,p=0.639;GAPDH组,p=0.773)。与此同时,对RNA样本前期处理时人工操作耽搁时间小于4小时,与耽搁时间24小时的样本进行比较时,结果显示组间差异没有统计学意义( Mann–Whitney U检验,β-actin组,p=0.477;GAPDH组,p=0.373 ),证实样品前期处理时耽搁的时间也并不会影响RNA样品功能。


DNA分离提取过程质控

最后,我们对本生物样本库常规进行一项生物流程——DNA提取实施了质控检测。我们从三组PBMC细胞样本中提取DNA,前后多次提取,不同时间所提取样本的浓度以及纯度等数值统计结果如表3所列。同时,我们记录了可以反应操作可重复性的样本CV值,CV值计算公式同前述。对于CV值比较低的样本,也就是样本纯度比较低的标记,这些样本要进行特别关注。


讨论

本篇研究的主旨是遵照 ISO 9001:2008 标准,对西班牙肾脏病研究系统(REDinREN)生物样本库内保存的样本质量与样本常规处理过程进行质控检测,并公布检测结果。所检测的样本包括冻存的PBMC细胞、DNA以及RNA样本,所进行的操作包括PBMC的分离提取、DNA的提取以及RNA提取过程。检测结果显示:该生物样本库内保存的样品质量良好,可以被用于后续生物医学研究,不仅适用传统的检测分析方法,而且对于新的高技术含量的检测也适宜。

首先,质控检测结果显示:想要获得大量的活性PBMC细胞,将其从全血中通过Ficoll细胞密度梯度离心法进行有效分离是关键。而本生物样本库中分离得到的PBMC细胞活性良好,而且细胞质量并不会因为冻存时间长久或者一次处理样本的数量太多而受到影响。

然后,将本生物样本库内低温保存之后的PBMC细胞进行解冻复苏,复苏后的细胞生物活性良好,这就说明整个细胞的冷冻、低温保存、解冻复苏过程均没有问题。PBMC细胞有效的低温保存对后续进行的研究非常重要,本生物样本库能够对PBMC进行有效的长期保存,并且保存质量不受冻存时间或者人工操作耽搁时间的影响,就使得来自同一个患者但在不同时间入库储存的样本能够后期同时处理,这样对进行样本的更有效的室间以及室内质控非常有益,而且所耗代价也可以相对比较低。前期有研究报道说明,低温保存之后的PBMC细胞生物活性对后续进行的功能研究实验有非常大的影响,因此,要进行有效实验,要求复苏后PBMC活性至少达到80%。而且,本样本库保存的质量良好的PBMC细胞也可以通过细胞表面抗原的免疫磁珠技术进行分离,也可以用于细胞因子的生产制备以及流式细胞学分析。

样本库中PBMC样本能够最长保存多长时间,这一点业内目前还没有共识,但是已经有很多在不同类型样本中进行的质控研究来试图解决这个问题。在本研究中,我们随机挑选了不同时间储存入库的样本进行检测,我们将不同年份存储的PBMC进行解冻复苏后,连续培养14天,然后检测了14天后依旧具有生物活性的细胞的比例,检测结果提示:长时间的冷冻储存可能并不会对样本活性质量造成影响。事实上,我们观察到,储存时间更长的PBMC细胞组,其生物活性反倒更高一点,差异几乎达到统计学意义。考虑这可能是因为近年来我们同一批次处理的样本数量,不论是同批处理或者同批运输转移的样本量都逐渐加大的缘故。鉴于本次检测样本数量相对较低,可以考虑扩大样本量再次对这一结果进行验证。我们现在正在遵照ISO 9001:2008标准, 进一步改善所有样品处理的流程、方案以及加强工作人员培训。这些研究结果对本生物样本库(REDinREN)的远期发展非常重要,因为我们的重要目标之一就是结合不同样本的临床数据信息,合理利用生物样本,更好的设计与实施具有应用前景的科学研究实验。

此外,有研究显示从静脉采血,也就是血液离体的时间到分离提取然后冷冻PBMC之间的时间间隔长短,有可能对细胞的质量、复苏、活性、白细胞亚群的分布、基因表达、淋巴细胞系转化,甚至T细胞免疫活性以及NK细胞的自然杀伤能力都会存在影响。而且,有证据显示,在血液收集和处理之间,如果时间间隔大于24h的话,尤其是在4°C时,很可能会增加血液中粒细胞污染,进而抑制T细胞功能。基于这些发现,有学者建议将血液采集与PBMC分离之间的时间间隔尽可能缩短,例如,控制在8h之内。当时,我们的生物样本库还没办法评估分离的PBMC中粒细胞污染。然而,在我们本次研究中,我们检测分析了不同长短时间间隔的样本,从2h-24h不等,然后我们分析比较了间隔时间少于4h与间隔时间24h的两组样本,尽管与24h时间间隔的样本比较,间隔时间小于4h的样本复苏之后活性细胞数量更高一点,但是差异却并没有统计学意义。而且,我们在其它一系列的实验中,均没有发现以处理时间间隔分组时,任何一项指标在这两组间的差异具有统计学意义。鉴于此次研究样本例数较少,我们考虑扩大样本量再次进行验证。再接下来的验证中,我们会提高生物样本处理效率从而尽可能提高活性细胞的得率、提高白细胞亚群的分布、并且提高细胞活性,从而使我们样本库中储存的生物标本在后续科研实验中得到更好的应用。

对核酸类型样本(DNA与RNA)的检测分析结果显示:根据所测得的标本A260/A280比值结果,所得的DNA与RNA核酸样本纯度适宜,可以被用于进行大部分的科研实验。大部分样本A260/A280比值在1.8-2.1范围,提示核酸样本纯度很高。而且,样本的纯度并不受存储时间长短而被影响,也就是说明长时间的冻存并不会损害样本质量。

事实上,大部分被分析的样本纯度比例适宜,都在正常值范围,只有小比例(DNA中9.4%,RNA样本6.1%)样本比值偏离了正常范围。在DNA分析来说,A260/A280的比值正常范围在1.8-2.1之间,通常认为比值在1.8以上就意味着DNA样本纯度很好,低于1.8时提示样本中可能存在蛋白污染,或者其它吸光度范围在A280或者在A280附近的物质的污染,或者是在核酸提取过程中使用不适宜的有机溶剂的关系。相反的,如果在提取的DNA样品中存在RNA的污染,A260/A280的比值范围会偏大,造成DNA预估纯度比正常值偏高。除了使用分光光度法,也可以使用荧光光谱测定法检测核酸的质量。在本实验室常规操作时,我们提取DNA时,为了不污染实验室以及QIAcube,我们并不会使用RNA酶对样本进行处理,因此,我们所检测得到的DNA纯度值是不排除RNA之外的预估值。不过,在提取所得的DNA样品中,即使混杂有RNA成分,对大多数后续科研实验并不会有明显影响。但是,在RNA的提取过程中,为了保证扩增结果的准确性,却应该常规使用DNA酶处理,避免RNA样品中存在DNA污染。在RNA分析中,当A260/A280比值大于1.8以上为,认为RNA纯度较好,没有蛋白污染。在上述提到的小比例偏离正常纯度范围的核酸样品,我们还没有找到样品纯度不好的原因,不过可以认为在样本操作或者运输过程中都是无差错的。对于这些不太符合的结果,我们采取了更正措施,经过修正处理之后的数据结果有较原数值相比,处于正常范围的数据减少了10%。

仅仅根据核酸样品的吸光度,并不能判断样品的完整性。检测核酸样品完整性的经典方法是琼脂糖凝胶电泳。我们同样也使用此法来检测核酸的完整性,检测结果显示,在电泳之后,完整的基因组DNA显示是一条高分子量的条带,而没有其它杂带。

此外,因为RNA是所有类型生物样本中最容易降解的一种,而且考虑到内源性核糖核酸酶的作用,我们采用RIN系数来评估RNA样本的完整性。在本研究中,所有被检测的96例RNA样本中,我们只检出其中9例RIN小于7,对于这些样本,我们在最后的数据中也采取了更正分析处理。

而且,本次研究结果显示RNA样本的RIN系数并不会随着存储时间的延长而系数逐渐降低,提示样本在生物样本库内冷冻存储时间并不会影响样品质量。关于样本的存储时间与RIN系数之间的关系,曾有几项相关的研究报道,2012年Bao等人花费40多个月时间收集了一系列组织提取RNA,并检测了其RIN系数,检测结果显示所有被检测的样本RIN均大于7。近来,Hebels等人在瑞典检测了已经冷冻储存时间在4-19年、冻存于-80°C的一组血液样品的RIN系数,并在意大利检测了冻存时间在11-19年、冻存于液氮的一组样品,均没有发现存储时间的长短对RIN系数的明显反作用。2013年,Andreasson等人检测存储时间已经接近30年的总共153例内分泌组织标本,检测结果显示:只要冷冻条件恒定,维持在-80°C,,这类型的冷冻库可以保存高质量的RNA样品甚至几十年,样品的冷冻保存时间长短与样品质量并不一定存在负相关关系。所有这些结果均对传统的说法造成挑战,传统人们常认为样品储存在液氮一定比在-80°C效果好,但是现在系列研究结果都证实:-80°C也能够长期储存生物样本,而不会对样本质量有明显影响。在REDinREN本生物样本库中,我们的RNA样本就是常规长期储存在-80°C冰箱中,不过,本样本库会定期例行检测RNA样本的RIN系数,以确保RNA样本质量一直恒定,可以满足后续科研实验的使用标准。

组织中所提取的DNA与RNA样本质量也可以使用PCR扩增的方式检测其质量,以确保可以被应用于后续分子生物学实验。当DNA样本经过PCR,RNA样本经过RT-PCR之后没有明显核酸反应产物的话,就提示原核酸样本存在降解,样本质量差。我们的检测结果中,所有核酸样本PCR扩增的CT值适宜,提示样本质量良好,可以被用于后续生物学实验。

我们同样也对操作步骤及流程进行了质控检测。我们检测结果显示,本样本库DNA提取操作流程具有可重复性,人工操作技术值是得信赖的。所提取的样本A260/A280比值变异度很低,提示DNA样本纯度良好。所提取DNA样本浓度稳定也说明操作具有可重复性。

直到目前为止,我们还没有对生物样本库内存储的血清或者血浆样品进行任何系统性或者例行的质控检测,因为,到目前为止科学界对如何选取最好的生物标记来验证血清以及血浆样品的质量还没有达成共识。最大的难题是要选择针对血浆及血液样本的广谱的特异性的检测很难,因为这两类标本的质量要求跟所进行的项目直接相关。在这个基础上,所有的生物样本库,包括REDinREN,都是一个很有价值的工具,因为我们生物样本库有能力设计系列的实验来不断优化操作过程以及筛选最佳的生物标记物来确保所有类型样本的质量。另外,我们生物样本库内储存的生物标本已经被多次应用于科学研究实验,已经有9篇同行评审学术论文发表,这些都说明我们的生物标本保存质量良好,适宜进行后续的系列生物学研究。

最后,值得说明的是,考虑到我们REDinREN生物样本库内所储存样本是在全西班牙多个医疗中心内收集的,样本从患者离体后需要经过运输然后才能到达本生物样本库,进而进行后续处理。我们因此也就用事实说明:只要在样本收集、运输、样本库接收、样本处理的过程中遵守严格的质控标准,建立大型的包含多个医疗中心的样本处理中心是完全有可能的。如表5所总结的是建立多中心的样本收集点时可能有的困难,以及在REDinREN内处理的办法。所有这些都是为了可以更好的协调所有的操作流程,培训工作人员,、运输过程中的技术操作,从而建立并实施更有效的、可以例行常规开展的技术指导。所有这些结果意义重大,因为到目前为止,关于从多中心内来源的生物样本的质控检测报道还非常少。


表5 REDinREN生物样本库内关于多中心收集生物样本中遇到困难及解决方案总结所有标本均是使用常规技术设施从多个医疗中心运到中心样本库


补充图表1(所有补充材料见www.liebertpub.com/bio)内,、获取以及鉴定客户的需求,分析结果的规范或者非规范化,决定实施改进以及提高方案时发挥的重要作用。


总结

一般来讲,要收集大规模数量的人体生物样本,并且要确定样本质量需要一系列的计划、建设并最终实施,而这是要消耗大量的时间,甚至有可能拖慢后续要进行的科研进度。因此,生物样本库的改进和实施使得研究者们可以获得保证质量的生物样本以及相关的样本信息,并且遵照相关的伦理学与法律标准保证样本来源患者的合法权益,有效的减少了科研实验与最终科研成果应用之间的时间间隔,提升了科研的效率。不过,在样本库的运行过程中,适当的质控保证所得样本的良好质量以及样本在长期冻存过程中质量不受损害是至关重要的。维持进而不断提高质控的质量是REDinREN运行时遵照的重要原则之一。

本研究检测结果显示:REDinREN内储存的DNA、RNA以及PBMC样本均符合所要进行的各类现代生物学研究所需的样本质量标准,样本库日常所进行的操作流程也符合标准,可以保证所储存样本的长期有效保存。

编者按:生物样本库是连接基础医学、转化医学、临床研究、临床治疗等的重要桥梁与平台,高质量的生物样本是评估疾病的组织学特性、研究患者基因型、转录组学以及蛋白质组学的重要来源。本文参照国际生物样本库质控标准(ISO 9001:2008),严格对西班牙肾脏病研究系统(REDinREN)生物样本库内所储存的样本进行质控分析,主要是检测了冻存DNA与RNA的纯度、完整性以及功能性,以及DMSO低温保存的PBMC生物活性。对于处理流程系统的质控,主要是DNA的提取。其实验方法以及质控标准值得我们借鉴学习。


作者:Calleros-Basilio L, et al 【Alcala University,  Spain】

编译:马文霞【山西医科大学第二医院】

校审:王晨【山西医科大学第二医院】


原文:【16179】

Quality Assurance of Samples and Processes in the Spanish Renal Research Network (REDinREN) Biobank. Biopreserv Biobank. 2016 Aug 19. [Epub ahead of print]doi:10.1089/bio.2015.0095

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27541936



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