实验室微生物样品收集与保存Tips

过去十年间，科学家们花费数十亿美元完成了人体、土壤和海洋等不同地点的微生物的分类归总，通过日益精确的新一代测序技术，我们对这些差别甚大的微生物有了更多的认识，比如说，对细菌核糖体小亚基 16S rRNA 编码基因进行高通量测序，科学家们能了解样品中的微生物多样性。此外还可以选择鸟枪宏基因组学作为互补技术，分析样品中所有生物的所有基因。这些DNA测序技术十分敏感，也能识别样品污染和危害样品处理引发的细微变化。

由于处理和存储样品的变化会影响研究结果，因此要想维持在现场收集样品的完整性也是微生物研究中的一项重大挑战。

来自Mayo医院的微生物生态学家 Vanessa Hale表示，金标准方法是从新鲜样本中立即提取DNA 或 RNA。当不可能立即处理的时候，最好能将样品储存在−80°C。室温下粪便样品中的微生物组成会在一到两天内发生转变，其它样品，如土壤也同样具有温度敏感性。

但是超低温冰箱并不是随取随到的，也许粪便样本首先在家里收集得到，或者研究人员需要从很远的地方收集土壤样品。在一些情况下，样品都需要存储和保留几天或几周，才能进行DNA和 RNA的提取和分析。

来自芝加哥大学的微生物生态学家 Jack Gilbert说，“微生物多样化多到可怕，而且复杂。任何特殊处理都会改变其组成部分。”不过随着技术发展，现在可以进行更多深入的微生物群落分析，即使是微生物菌群最小的变化或者相对丰度改变，也会极大的干扰群体比对，因此储存方法引起的变化越小越好。以下是The Scientist杂志推荐的一些样品保存技巧。

美国加州大学戴维斯分校的微生物学家Holly Ganz在一家非盈利机构KittyBiome进行野猫和家猫的微生物组研究，他们一般采集野猫和家猫的粪便作为样品，她说，“粪便当然不是均质的，因此这就产生了一个问题：采用哪一部分的粪便会影响研究结果。”

因此Ganz需要均质化样品，她首先去除了粪便的外层，这一部分可能包含有环境污染物，然后剩余部分放置到塑料袋中进行人工碾磨和混合。之后Ganz又将样品铺开，收集二次样品，“要让粪便样品均质化并不容易，所以我只好增加二次取样的次数，”她说。

2015年，一组研究人员完成了一项人肠道微生物组的研究，他们将液氮粪便样品通过研钵及研杵捣碎，使之成为粉末状小样品，然后转移到试管中，−80°C储存。比较于之前的方法，这种制备样品的方法能减少微生物组成上出现的可变性。（Methods for Improving Human Gut Microbiome Data by Reducing Variability through Sample Processing and Storage of Stool）

土壤样品具有更加复杂的组分，Gilbert建议将土壤样品放到搅拌机中，充分搅碎颗粒物。他说，“不可能完全均质化。”

此外，研究人员也建议在初次收集样品后再进行多次等分分装，因为多次反复冻融会破坏核酸，这一点其实很多实验室研究人员都知道。比如研究人员可以采用无菌一次性活检钳（biopsy punch）从一个更大的原始样品中收集几乎相同大小的冻存粪便颗粒，然后直接将这些颗粒放入含有核酸裂解液中的提取管中。这种方法就是对原始样品进行等分，但可以为科学家们节约整整一次冻融重复循环。

这种方法可让受试者在家里收集微生物样品，然后运至实验室进行多种类型的分子分析。尽管采用不同的取样方法，微生物种类、基因和基因转录组成，在所有样品中都是一致的。随后就对这些样品进行的分析显示，测量的人类微生物组的功能潜力和功能活性之间存在的异同点。

这种方法提供了将来进行大规模研究的机会。随着测序技术的灵敏度和计算工具的改进，我们可以检测到很细微的变化。（Relating the metatranscriptome and metagenome of the human gut）

低温冻存保存剂也很多种，如甘油就能避免水结冰产生冰晶损伤细胞。要选择哪一种，这取决于你的研究项目和样品需求。

如果你想要培养细菌或者需要微生物保持活性，那么就可以考虑选择甘油，这种化合物能在低至零下20-80度的温度下防止冰晶形成，因此我们实验室中不少菌种保存采用的是甘油。

OpenBiome是麻省的一家非盈利性粪便库，收集健康人的粪便样品，用于治疗感染艰难梭状芽孢杆菌（Clostridium difficile）的患者。艰难梭状芽孢杆菌是一种常见的厌氧细菌，会产生肠毒素和细胞毒素，导致住院病人腹泻。人们通常认为，艰难梭菌的感染主要是在医院环境下传播的。

由于粪便移植治疗的成功取决于存在活的细菌，因此粪便样品需要与含有12.5%甘油的盐溶液混合，这样才能在−20°C下保存六个月，−80 °C保存两年。

如果只是计划分析核酸组成，那么选择更多。就这种类型的研究而言，在储存样品前可以将其加入到一种裂解缓冲液中。虽然很少有研究比对不同的低温冻存保护剂在维持原始样品多样性方面的作用，但是目前的证明表明，低温冻存保护剂会在不同程度上影响不同微生物物种的构成（Effect of preservation method on spider monkey (Ateles geoffroyi) fecal microbiota over 8 weeks）。

“关键在于选择一种可靠，并且适合你的研究的方法，同时也要注意到其潜在的误差”，Hale建议道。

总的说来，研究人员已经发现加入一种低温冻存保护有助于人体样品的保存。Ganz指出，在比较储存样品和新鲜样品中的微生物组成之前，可以采用一种快速的方法，来评估保护剂的作用，那就是检测一下样品DNA的量，“如果DNA量不足，那么你采用的方法也许并不适用于这种微生物的保存。”

DMSO + Trehalose & Tryptic Soy Broth

Heylen采用了一种混合溶剂：二甲基亚砜（DMSO）与海藻糖，胰酶大豆肉汤（Tryptic Soy Broth， TSB），这能用于保持三种不同微生物组系统冷冻样品的保真性（Optimized Cryopreservation of Mixed Microbial Communities for Conserved Functionality and Diversity）。

“海藻糖能防止细胞干燥，TSB也是一种低温冻存保存剂，”Heylen建议在将这一溶液加入到样品中之前，先放置到4°C中，然后再与样品混合，保存到超低温冰箱里去。“如果无法放到−80°C冰箱，那么也可以用家用冰箱，但是样品要尽可能早的冻存，而且需要加入低温冻存保护剂。”

RNAlater

RNAlater最初是作为一种RNA保存剂，由Qiagen和Thermo Fisher等厂家开发出来的（前者当地价格为：50mL的78美元，250mL的324美元；后者当地价格为100mL的125美元，500mL的386美元），现在可以用于保存DNA。

RNAlater是特殊的样品储存液，只要在采样后立即将新鲜样品浸入这种液体试剂，RNlater可以迅速渗透到组织或其他生物样本中，稳定并保护RNA完整而不被降解，确保下游分析得到的数据真实反应样品的表达信息。样品储存液中保存的新鲜样品可以在不超过37度的高温天气下保存一天，或者在25度室温下保存一周；或者4度冰箱存放一个月；或者负20度长期保存而使RNA保持完整免受降解。这种技术为在不同温度和不同地点下的采样、运输和保存样品提供了极大的方便，同样适合手术/解剖过程中部分样品的保存。RNAlater：彻底告别RNA降解的烦恼 

人类微生物组计划(Human Microbiome Project)的参与研究人员，来自哈佛大学的计算生物学家Curtis Huttenhower与他的同事们发现在样品收集后，如果没有冰箱，那么可以加入这种保护剂使用。

不过一些用户也报告了RNAlater的缺陷，虽然RNAlater不可燃，因此可以用于样品运输，但是这种保护剂会降低Bacteroidetes 和 Ruminococcaceae 两种细菌新鲜提取后的菌群数量。另外就是如果想获得样品高RNA产量，那么就必须先将其去除。Ganz表示，“RNAlater会妨碍样品正常形成颗粒沉淀，因此在去除RNAlater之后，还必须磷酸盐缓冲液进行清洗。”

此外，Woods Hole海洋研究所海洋生物化学家Mak Saito也指出，RNAlater还有一个问题，那就是其高盐含量，因此在一些实验中会令样品清洗成为问题。Saito曾采用这种溶液保存海洋微生物组中的蛋白组成（Examination of Microbial Proteome Preservation Techniques Applicable to Autonomous Environmental Sample Collection）。

Ethanol

乙醇是一种相对于RNAlater更加便宜的替代选择，研究已证实这种物质即便是在室温下，也能在超过8周的时间里稳定地保存粪便样品中的微生物菌落结构（J Microbiol Meth, 113:16-26, 2015）。

但是乙醇是可燃的，因此不能用于样品运输，还有更重要的是，添加乙醇的低温冻存保护剂会导致Cyanobacteria比新鲜采集时的样品，数量增加。“所有这些储存方法都存在偏差，因此研究过程中需要保证保存方法的一致性，”Ganz说，她的同事就建议她将猫粪便样品保存70%的乙醇中。

不使用低温冻存保护剂

对于一些类型的实验样品来说，如果加入低温冻存保护剂就会大幅度改变微生物组成，这样做划不来。Gilbert表示，土壤样品就是这种情形。他建议在-80℃温度下将土壤样品冻存48小时，“我们希望看到的是样品在收集的那一刻的微生物菌落组成与结构，”他说。在土壤样品非常潮湿的环境里，Gilbert推荐应该立即冻存这些样品，因为湿度很高会引发某些微生物类型增殖。

而对粪便样品而言，有时低温冻存也许并不合适，比如说，用于治疗艰难梭菌感染的样品能在室温下保存长达6个小时，而且还不会引起治疗疗效发生显著变化。

其他温度因素

微生物组样品对于冻融循环非常敏感。“样品解冻会导致微生物发生验证偏差，”Hale说，“随着每次解冻循环，DNA都会降解，污染和微生物大量生长的机会也就会随之出现，并且挥发性化合物也会丢失，无法在代谢组学分析中复原。”

如果你手头上只有-20℃冰箱，那么最好用一台冰箱单独储存微生物组样品。Heylen说，“如果-20℃冰箱老是打开，温度就会变得不稳定，样品储存成功率会显著降低。”

在著名“收购大便”的OpenBiome公司中，研究人员会在将样品转移到-80℃超低温冰箱之前，会先在-20℃冰箱中放置六个月，样品转移并不会影响微生物，Blackler说，但是“温度突然升高也许会影响微生物菌群，因此应该尽可能避免。”