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血液ctDNA-EGFR标准化检测,三个关键环节全掌握

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导 读

非小细胞肺癌是最为常见的肺癌,占肺癌总数的80%,其治疗前需检测EGFR基因突变已成共识。这篇文章主要为大家介绍非小细胞肺癌血液EGFR基因突变检测的三个重要环节——标本采集及处理、cfDNA的提取、EGFR突变检测。

非小细胞肺癌(NSCLC)中EGFR基因突变状态与EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)疗效预测的相关性早已被证实,NSCLC治疗前需检测EGFR基因突变也已成共识。但是在临床实践中,首先,多数肺癌患者确诊时往往已到晚期,其中相当部分肿瘤组织标本难以获取,导致无法进行EGFR检测;另外,部分患者肿瘤内EGFR基因突变的异质性使基于基因检测的靶向治疗决策变得更加困难;最后,我国的EGFR基因突变检测在肺癌患者中的受检率相对偏低,吉林肿瘤医院程颖教授在2017 WCLC会议报告上指出:相对于欧美接近100%的检测率,中国北方三级甲等和肿瘤医院中,肺癌的EGFR检测率也仅仅只有46%。因此,针对临床实践中肿瘤组织检测的种种局限,探寻作为其补充或替代的其他生物标本进行EGFR基因检测具有重要临床意义,也有助于提高临床患者的总体EGFR基因受检率。


近些年,以血液等为样本基础的液体活检技术飞速发展。多项研究表明[1-3],大部分晚期NSCLC患者的血液中存在循环游离DNA(cfDNA)及循环肿瘤DNA(ctDNA);并且已有研究显示外周血ctDNA EGFR基因突变检测结果对EGFR-TKIs疗效有预测作用[2,4-5]。因此,当肿瘤组织难以获取时,无创、易采集的血液检测就是组织EGFR基因突变分析合适的替代选择,并且血液检测在一定程度上能有效克服肿瘤异质性,可实现无创实时动态检测等。


标准化的检测流程是保障ctDNA-EGFR血液检测质量的前提,临床专家对于血液检测应用规范问题也多有探讨,并于2015年12月8号在《中华医学杂志》上发表了由吴一龙、王洁等教授整理的《非小细胞肺癌血液EGFR基因检测中国专家共识》。其中,标本采集及处理、cfDNA的提取、EGFR突变检测是血液检测的三个重要环节。


一、血液EGFR基因突变检测之标本采集及处理

患者选择

研究显示,肿瘤分期越高,ctDNA检出率越高[6],即III或IV期的肿瘤患者血液中的ctDNA相较Ⅰ/Ⅱ期的患者含量更高,更容易被检出。因此,为提高血液EGFR检出率,建议选择晚期患者。


须知药物治疗过程中,EGFR突变情况以及ctDNA的浓度可能发生变化。如下图所示:


标本采集及分离

全血中血浆和血清均能分离出ctDNA,但研究显示,相对于血清标本,血浆中ctDNA有更高的检出率[8]。另外,对同一患者,血浆量越多所提取的DNA量就越多,其中含有的cfDNA量就越多,对检测越有利[9],如下图所示:

因此按照专家共识[10]建议采集10ml全血(可分离4-5ml血浆),采集完成后需温柔颠倒混匀,以便于抗凝剂或保护剂充分与血液接触。

此时需根据使用的采血管类型(常规EDTA抗凝管/专用常温采血管)进行不同的后续操作。

(1):用常规EDTA抗凝管采集全血后,为防止游离DNA的降解,避免野生型DNA背景的增加,建议两小时内以足够的离心力将全血充分低温离心两次[11],分离出不含细胞成分的血浆,吸取操作如下图所示,分离出的血浆放置于-70℃冻存直至DNA抽提,或直接进入DNA抽提步骤(备注:离心前临时保存应暂放于2~8℃冷藏);

(2):用含有游离DNA保护剂及防细胞裂解保护剂的专用常温采血管采集后轻摇混匀,常温放置不超过5-7天,以足够的离心力将全血充分离心两次,分离出不含细胞成分的血浆,放置于-70℃冻存直至DNA抽提,或直接进入DNA抽提步骤。如果外送运输全血,建议使用cfDNA专用常温采血管。

禁用肝素抗凝管由于肝素使得DNA抽提得率降低并在DNA提取过程中难以去除,肝素也会导致PCR效率降低,因此cfDNA检测血液采集禁用肝素抗凝管。

血浆质量评价

(1)血浆是否溶血:如发生严重溶血,标本不可用,血红蛋白及其代谢产物可能抑制Taq酶活性,使PCR扩增效率明显降低。

(2)血脂是否过高:血脂过高,使血浆呈乳白色,低密度脂蛋白对荧光有屏蔽和吸收作用,故对PCR有干扰。


二、血液EGFR基因突变检测之cfDNA提取

10ml全血分离出的4-5ml血浆用于cfDNA的提取,目前可用于cfDNA提取的方法很多,有实验室自建方法,也有商用核酸提取试剂盒。建议采用国家药监部门批准的、大容量血浆游离DNA分离试剂盒。


所提取的cfDNA建议马上使用,若不能立即进行后续检测而需要储存cfDNA,首选-80℃冰箱冻存。若无-80℃冰箱,可选择-20℃保存,应尽可能缩短冻存时间,尽快进行后续检测。冻存时注意密封及标记完整,避免反复冻融。


三、血液EGFR基因突变检测

,可通过血液ctDNA检测EGFR基因突变指导吉非替尼治疗。近期,CFDA更是通过创新医疗器械特别审批的方式,快速批准艾德生物自主创新产品Super-ARMS® EGFR检测试剂盒(Super-ARMS技术是在原有ADx-ARMS技术优势基础上,优化引物探针设计和反应体系,将检测灵敏度提升至0.2%,完全适用于对灵敏度要求更高的血液检测领域)用于血液ctDNA-EGFR基因突变的检测。由此可见,ctDNA-EGFR标准化检测的时代已经到来!


为了降低假阳性概率,推荐使用经国家药监部门批准的高敏感度的检测方法用于ctDNA样本的EGFR基因突变检测。专家共识中也指出,检测必须在具有资质的检测中心进行。检测方法必须进行严格的验证及质控。检测试剂须使用经CFDA批准的检测试剂盒。目前,检测基因突变最常用的方法是扩增阻遏突变系统(ARMS法),欧盟批准用于指导吉非替尼治疗的血液检测方法也是ARMS检测方法。而Super-ARMS®方法是CFDA批准用于血浆中EGFR突变检测的敏感度最高的ARMS方法,其检测灵敏度可达0.2%。


根据今年ESMO(欧洲临床肿瘤协会年会)大会上,上海肺科医院周彩存教授、广东省人民医院吴一龙教授等多位肺癌权威专家共同发布的AURA 17扩展研究数据可知[12],Super-ARMS® 技术检测血浆T790M突变的阳性检出率仅次于目前灵敏度最高的ddPCR技术,更重要的是,Super-ARMS®技术检出的血液T790M突变阳性患者服务奥希替尼的客观响应率(ORR)最高,高达64%,说明灵敏度0.2%的Super-ARMS®技术是临床血液ctDNA检测的最优选择,疗效预测的准确性最高,是血液检测临床应用的可靠技术。

总之,血液EGFR突变检测的标准化、合规化是保证检测准确率的核心,在减少操作流程对检测结果影响的前提下,选择经国家药监部门严格审批上市的检测产品和合规专业的检测机构也是至关重要的。

 

参考文献:

1、 Goto K, Ichinose Y, Ohe Y, et al., Epidermal growth factor receptor mutation status in circulating free DNA in serum: from IPASS, a phase III study of gefitinib or carboplatin/paclitaxel in non-small cell lung cancer[J]. J Thorac Oncol, 2012, 7(1):115-121.

2、 Karachaliou N, Mayo-de las casas C, Queralt C, et al., Association of EGFR L858R Mutation in Circulating Free DNA With Survival in the EURTAC Trial[J]. JAMA Oncol, 2015,1(2):149-157.

3、 Yung TK, Chan KC,Mok TS,et al., Single-molecule detection of epidermal growth factor receptor mutations in plasma by microfluidics digital PCR in non-small cell lung cancer patients[J].Clin Cancer Res,2009,15(6):2076-2084.

4、 Bai H, Mao L,Wang HS,et al., Epidermal growth factor receptor mutations in plasma DNA samples predict tumor response in Chinese patients with stages IIIB to IV non-small-cell lung cancer[J].J Clin Oncol,2009,27(16):2653-2659.

5、 Kimura H,Kasahara K,Kawaishi M,et al., Detection of epidermal growth factor receptor mutations in serum as a predictor of the response to gefitinib in patients with non-small-cell lung cancer[J].Clin Cancer Res,2006,12(13):3915-3921.

6、 Bettegowda C,Sausen M,J. Leary R,et al., Detection of Circulating Tumor DNA in Early- and Late-Stage Human Malignancies[J].Sci Transl Med,2014, 6(224):224-247.

7、 Zheng D,Ye X, Zhang MZ, Y. Sun, et al., Plasma EGFR T790M ctDNA status is associated with clinical outcome in advanced NSCLC patients with acquired EGFR-TKI resistance[J].Sci Rep.2016,6:20913-20921.

8、 Vallée A, Marcq M,Bizieux A, et al.,Plasma is a better source of tumor-derived circulating cell-free DNA than serum for the detection of EGFR alterations in lung tumor patients[J].Lung Cancer,2013,82(2):373-374.

9、 Sherwood JL,Corcoran C,Brown H, et al., Optimised Pre-Analytical Methods Improve KRAS Mutation Detection in Circulating Tumour DNA (ctDNA) from Patients with Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC)[J]. . PLoS ONE 11(2): e0150197.

10、 非小细胞肺癌血液EGFR基因突变检测中国专家共识,中华医学杂志,2015,95(46):3721-3725.

11、 EI Messaoudi S,Rolet F, Mouliere F,et al., Circulating cell free DNA: Preanalytical considerations[J].Clin Chim Acta,2013,424:222-230.

12、 AURA 17 , ESMO 2017.


(来源:转化医学网)


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